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威尼德紫外交联仪:EMSA实验中常见问题总结

更新时间:2022-07-25      点击次数:1227

威尼德生物科技(北京)有限公司,使用UVA(365nm)UVB(302 nm)UVC(254 nm)三种波长制造了四款紫外交联仪,主要包括VL-1000A系列紫外交联仪(365nm)、VL-1000B系列紫外交联仪(302nm)、VL-1000C系列紫外交联仪(254nm)、VL-3000系列紫外交联仪(三种波长)满足不同的科研需求。

1、为什么看不到迁移带?

1)蛋白样本提取质量不高,蛋白降解或者提取量不足。

2)样本中没有可以与探针结合的蛋白。

3)探针与蛋白无特异性的相互作用。

4)转膜效率低,蛋白或者探针未转移到膜上。

5)曝光或者成像时间过短。

Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因:

6)抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA,只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA

7)测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带,也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少

8)使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。

9)多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下,虽然看不到Super-Shift的带,但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。

威尼德生物科技(北京)有限公司,使用UVA(365nm)UVB(302 nm)UVC(254 nm)三种波长制造了四款紫外交联仪,主要包括VL-1000A系列紫外交联仪(365nm)、VL-1000B系列紫外交联仪(302nm)、VL-1000C系列紫外交联仪(254nm)、VL-3000系列紫外交联仪(三种波长)满足不同的科研需求。

2、为什么实验背景高?

1)曝光或者成像时间过长。

2)封闭时间不足或者效率不高。

3)洗涤效果不佳。

4)实验过程中膜没有一直处于湿润状态。

3EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针?

 

威尼德生物科技(北京)有限公司,使用UVA(365nm)UVB(302 nm)UVC(254 nm)三种波长制造了四款紫外交联仪,主要包括VL-1000A系列紫外交联仪(365nm)、VL-1000B系列紫外交联仪(302nm)、VL-1000C系列紫外交联仪(254nm)、VL-3000系列紫外交联仪(三种波长)满足不同的科研需求。

对每一个特定的结合蛋白和探针,所用的纯化蛋白,部分纯化蛋白,粗制核抽提液需作优化:一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间,可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA5倍;用粗制核抽提液,需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。

部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应保存在-20℃以防止降解。

无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。

4Poly(dI:dC),非特异性竞争DNA,特异性竞争DNAEMSA测定中的作用?

Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶组成。在EMSA反应中加入poly(dI:dC),可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式实验前进行优化,一般用量大约在0.05mg/ml左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时,不必一定加入poly(dI:dC),如加入,则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液,每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)

为确定所形成的复合物的特异性,在含或不含增量的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时,作结合反应的竞争实验。一般,特异竞争探针是非标记的DNA,其序列与标记探针相同,故能与标记探针竞争与结合蛋白的反应。非特异竞争探针的长度组成和DNA探针相同,但序列不同。如果结合蛋白与标记探针的结合被特异竞争探针抑制,而不受非特异探针的影响表明靶结合蛋白的存在。特异与非特异性竞争DNA的用量也需优化或滴定,但竞争DNA通常是标记的探针用量的30-100倍(w/w)。


5、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开?

将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合,蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%,在特定条件下可用高或低的浓度。也可将TGE缓冲液(12.5mM TrispH8.395mM 甘氨酸,0.5mM EDTA)用于不稳定的蛋白/DNA复合物。在4℃进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。

当带型不紧密出现拖尾时,表明复合物存在解离。凝胶必需*聚合,以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量,或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物,但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染,应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。威尼德生物科技(北京)有限公司,使用UVA(365nm)UVB(302 nm)UVC(254 nm)三种波长制造了四款紫外交联仪,主要包括VL-1000A系列紫外交联仪(365nm)、VL-1000B系列紫外交联仪(302nm)、VL-1000C系列紫外交联仪(254nm)、VL-3000系列紫外交联仪(三种波长)满足不同的科研需求。