探索自然与科技的交汇菊花转基因之旅

摘要：菊花转基因研究这一前沿领域。阐述了菊花在观赏植物领域的重要地位以及转基因技术应用于菊花改良的意义。详细描述了从菊花材料准备、基因选择与构建到转基因具体实验操作的全过程，包括农杆菌介导转化、基因枪转化等方法，并对转基因菊花的筛选、鉴定技术进行了讨论。通过对转基因菊花的表型分析和潜在应用前景的展望，为菊花遗传改良和相关领域研究提供了全面而深入的理论与实践参考。

一、引言

菊花（Chrysanthemum morifolium）作为世界著名的观赏花卉之一，以其丰富的花色、花型和更好的观赏价值而备受喜爱。在花卉产业中，菊花占据着重要地位。然而，传统的菊花育种方法在某些性状改良方面存在局限性，如对病虫害的抗性、花色和花期的精准调控等。随着现代生物技术的飞速发展，转基因技术为菊花的遗传改良带来了新的契机。通过将外源基因导入菊花基因组，可以赋予菊花新的优良性状，突破传统育种的瓶颈，同时也为研究菊花的生长发育机制提供了有力工具。在自然与科技的交融点上，菊花转基因研究开启了一段充满挑战与机遇的旅程。

二、材料与方法

（一）植物材料

选择健康、生长旺盛的菊花品种作为实验材料。一般选取幼嫩的叶片、茎段或花瓣作为外植体来源。这些外植体在取材后需迅速进行预处理，以保持其细胞活性和降低污染风险。例如，将外植体用流水冲洗 15 - 30 分钟，然后在无菌条件下用 70% - 75% 的乙醇浸泡 30 - 60 秒，再用含有适量表面活性剂的消毒剂（如 0.1% - 0.2% 的氯化溶液）浸泡 5 - 10 分钟，最后用无菌水冲洗 3 - 5 次。

（二）基因选择与构建

目的基因确定

根据期望赋予菊花的性状来选择目的基因。例如，如果要提高菊花对病虫害的抗性，可以选择来自其他抗虫抗病植物的相关基因，如苏云金芽孢杆菌（Bt）毒蛋白基因用于抗虫，或一些病程相关蛋白基因用于抗病。对于花色改良，可选择参与花色合成途径的关键基因，如查尔酮合酶（CHS）、类黄酮 3',5'- 羟基化酶（F3'5'H）等。花期调控方面，则可以选择与开花时间相关的基因，如 CONSTANS（CO）基因及其同源基因。

载体构建

将目的基因克隆到合适的植物表达载体上。常用的植物表达载体有 pBI121、pCAMBIA 系列等。在构建过程中，需要考虑启动子的选择。例如，使用花椰菜 mosaic 病毒（CaMV）35S 启动子可以实现基因在菊花中的高效表达。同时，为了便于筛选转基因植株，通常会在载体上同时构建标记基因，如抗生素抗性基因（如卡那霉素抗性基因 nptII）或报告基因（如绿色荧光蛋白基因 GFP）。通过限制性内切酶酶切和连接反应等分子生物学技术，将目的基因与载体正确连接，形成重组表达载体。

（三）转基因方法

农杆菌介导转化法

农杆菌菌株选择与培养

选择具有高效转化能力的农杆菌菌株，如 LBA4404、GV3101 等。将含有重组表达载体的农杆菌接种于含有相应抗生素的液体培养基（如 LB 培养基）中，在 28℃、200 - 250rpm 的条件下振荡培养至对数生长期（OD600 = 0.6 - 0.8）。

共培养

将预处理后的菊花外植体浸泡在活化好的农杆菌菌液中 10 - 30 分钟，然后用无菌滤纸吸干多余菌液。将外植体转移到共培养培养基上，共培养培养基一般为添加了适量乙酰丁香酮（AS）的 MS 基本培养基。共培养条件为黑暗、22 - 25℃，培养 2 - 3 天。在此过程中，农杆菌将重组表达载体上的 T - DNA 转移到菊花细胞基因组中。

脱菌与筛选培养

共培养结束后，将外植体转移到含有抗生素（如头孢噻肟钠）的脱菌培养基中，以去除农杆菌。经过多次（一般 2 - 3 次）更换脱菌培养基，确保农杆菌被完整清除。然后，将外植体转移到含有筛选抗生素（如卡那霉素）的筛选培养基上进行培养。在筛选培养基上，只有成功转入目的基因（同时含有抗性基因）的细胞才能正常生长和分化。经过数周的培养，可观察到抗性愈伤组织或芽的形成。

基因枪转化法

微弹制备

将重组表达载体 DNA 与金粉或钨粉混合。一般将 1 - 2μg 的 DNA 与 50 - 60mg 的金属微粒在含有一定浓度 CaCl₂和亚精胺的溶液中混合，使 DNA 吸附在金属微粒表面。通过离心、洗涤等操作获得均匀的微弹悬浮液。

基因枪轰击

将菊花外植体放置在基因枪的靶盘上，调节基因枪的参数，如氦气压力、轰击距离等。一般氦气压力设置为 7.5 - 1300psi，轰击距离为 6 - 9cm。利用高压氦气将微弹加速并轰击到外植体表面，使微弹携带的 DNA 进入菊花细胞。轰击后的外植体转移到合适的恢复培养基中，在黑暗条件下培养 1 - 2 天，然后转移到正常的筛选培养基上进行后续培养和筛选。

（四）转基因菊花的筛选与鉴定

筛选方法

基于标记基因的筛选

在筛选培养基上，利用标记基因赋予的抗性或可见表型进行初步筛选。如对于含有卡那霉素抗性基因的转基因植株，在含有卡那霉素的培养基上，非转基因植株会因无法抵抗抗生素而死亡，而转基因植株则能够正常生长。对于携带报告基因（如 GFP）的植株，可以通过荧光显微镜直接观察到绿色荧光，从而快速识别转基因细胞或植株。

分子生物学鉴定

采用聚合酶链反应（PCR）技术，利用针对目的基因和标记基因的特异性引物，对疑似转基因植株的基因组 DNA 进行扩增。如果能够扩增出预期大小的条带，则初步表明目的基因已经整合到菊花基因组中。进一步通过 Southern blotting 技术，可以确定目的基因在菊花基因组中的拷贝数和整合情况。

表型鉴定

根据目的基因的功能，对转基因菊花进行表型分析。对于抗虫基因导入的植株，通过人工接种害虫或在自然虫源环境下观察植株受虫害的情况。对于花色改良基因导入的植株，观察花朵颜色的变化，并通过高效液相色谱（HPLC）等技术分析花色相关色素的含量和种类变化。对于花期调控基因导入的植株，记录植株的开花时间，并与野生型菊花进行对比分析。

三、结果

通过农杆菌介导转化或基因枪转化等方法，并经过严格的筛选和鉴定，成功获得了转基因菊花植株。在抗虫转基因菊花实验中，接种害虫后发现，与野生型菊花相比，转基因植株受到的虫害明显减轻，叶片和花朵的受损程度显著降低，表明抗虫基因在菊花中得到了有效表达并发挥了作用。在花色改良方面，导入特定花色基因的菊花植株呈现出了预期的花色变化，如原本白色的菊花品种在导入 F3'5'H 基因后，花朵颜色变为蓝色或紫色，HPLC 分析结果也显示相应花色色素含量增加。花期调控转基因菊花的开花时间出现了提前或延迟的现象，与野生型菊花相比差异明显，证明导入的花期调控基因对菊花的开花过程产生了影响。

四、讨论

（一）转基因方法的优化

在菊花转基因过程中，农杆菌介导转化法和基因枪转化法各有优缺点。农杆菌介导转化法操作相对简单，成本较低，但对某些菊花品种的转化效率可能不高，且易受农杆菌菌株和外植体类型的影响。基因枪转化法不受宿主范围限制，可用于不同基因型的菊花，但设备昂贵，操作复杂，且可能会对细胞造成较大损伤。因此，需要进一步优化这两种方法，如通过改进农杆菌侵染条件、选择更合适的外植体和载体，以及优化基因枪轰击参数等，来提高转基因效率和降低对植株的不良影响。

（二）基因表达的稳定性与调控

虽然在转基因菊花中观察到了目的基因的表达和相应的表型变化，但基因表达的稳定性是一个需要关注的问题。在长期的生长过程中，可能会出现基因沉默或表达水平变化的情况。这可能与转基因的整合位点、甲基化修饰等因素有关。因此，需要深入研究基因表达的调控机制，探索如何确保目的基因在菊花整个生命周期中稳定、高效地表达。

（三）转基因菊花的安全性与环境影响

随着转基因技术的应用，转基因菊花的安全性和对环境的潜在影响也备受关注。在释放转基因菊花到自然环境之前，需要全面评估其对生态平衡的影响，如是否会对本地昆虫、微生物等生物群落产生负面影响，以及转基因是否会通过花粉传播等途径扩散到野生菊花种群中。同时，对于作为观赏花卉的转基因菊花，还需要考虑其对人类健康的潜在风险，如是否会引起过敏反应等。

五、结论

菊花转基因研究在探索自然与科技的交汇中取得了显著成果。通过合理选择目的基因、构建合适的表达载体以及运用有效的转基因方法，成功实现了对菊花性状的改良，包括抗虫性增强、花色改变和花期调控等。然而，在转基因技术的应用过程中，仍面临着许多挑战，如转基因方法的优化、基因表达稳定性和安全性评估等。未来的研究需要进一步深入解决这些问题，以充分发挥转基因技术在菊花遗传改良中的潜力，推动菊花产业的可持续发展，同时保障生态环境和人类健康的安全。通过持续的努力，菊花转基因研究将在自然与科技的融合之路上不断前行，为花卉领域带来更多的创新和惊喜。