农杆菌介导法在大豆转基因中的应用

一、引言

大豆作为全球重要的粮食作物和油料作物，其产量和品质对于保障粮食安全和满足工业需求具有至关重要的作用。随着现代生物技术的发展，转基因技术为大豆的遗传改良提供了强有力的手段。农杆菌介导法作为一种广泛应用的转基因方法，在大豆转基因研究中占据着重要地位。

农杆菌是一种天然的植物基因工程载体，它能够将自身 Ti（肿瘤诱导）质粒或 Ri（毛根诱导）质粒上的 T - DNA（转移 DNA）转移并整合到植物基因组中。这种特性使得农杆菌介导法具有更好的优势，如基因转移效率相对较高、插入片段较为稳定、可转移较大的 DNA 片段且能准确整合到植物基因组中，有利于获得稳定遗传的转基因植株。在大豆转基因研究中，利用农杆菌介导法可以将具有重要农艺性状的基因，如抗虫、抗病、抗逆和品质改良相关基因导入大豆，从而培育出优良的大豆新品种。然而，大豆作为一种难转化的作物，农杆菌介导的大豆转基因过程面临着诸多挑战，需要深入研究和优化各种实验条件以提高转化效率和获得理想的转基因植株。本文将详细阐述农杆菌介导法在大豆转基因中的应用，包括从实验原理到具体操作步骤以及相关影响因素的分析。

二、农杆菌介导大豆转基因的原理

农杆菌介导的基因转移主要基于农杆菌的天然遗传转化系统。当农杆菌感染植物伤口时，Ti 质粒或 Ri 质粒上的 T - DNA 边界序列被识别，位于边界序列之间的 T - DNA 可以被切割下来，并在农杆菌毒蛋白的帮助下转移到植物细胞内。在植物细胞中，T - DNA 可以随机整合到植物基因组中。在大豆转基因应用中，将目的基因构建到含有 T - DNA 边界序列的载体上，通过农杆菌侵染大豆外植体，使目的基因随着 T - DNA 一起转移到大豆细胞基因组中，经过组织培养和筛选，获得转基因大豆植株。

三、农杆菌介导大豆转基因的实验流程

（一）农杆菌菌株和载体的选择

农杆菌菌株

不同的农杆菌菌株对大豆的侵染能力和转化效率存在差异。常用的菌株有根癌农杆菌 EHA101、EHA105、LBA4404 等。这些菌株具有不同的 Vir（毒性）基因表达水平和特性，影响着 T - DNA 的转移效率。例如，EHA105 菌株含有较高活性的 Vir 基因，在一些大豆品种的转化中表现出较好的效果。在选择菌株时，需要综合考虑大豆品种、目的基因类型等因素。

载体构建

构建含有目的基因的植物表达载体是关键步骤。载体通常包含 T - DNA 边界序列、目的基因、启动子、终止子和选择标记基因等元件。启动子的选择对于目的基因在大豆中的表达水平至关重要，常用的启动子有 CaMV 35S 启动子、大豆自身的组织特异性启动子（如种子特异性启动子）等。选择标记基因用于筛选转基因植株，如抗除草剂基因（如 bar 基因，赋予对草铵膦的抗性）或抗生素抗性基因（如 nptⅡ 基因，赋予对卡那霉素的抗性）。将目的基因正确地插入到载体的合适位置，并确保载体的完整性和稳定性，通过酶切和测序等方法进行验证。

（二）大豆外植体的准备

外植体类型选择

大豆的多种组织都可以作为外植体进行农杆菌介导的转化，包括子叶节、下胚轴、未成熟胚等。子叶节是目前应用较为广泛的外植体类型，因为它具有较高的再生能力和对农杆菌侵染的耐受性。未成熟胚则在某些特定的转化体系中具有优势，例如对于一些需要特定发育阶段表达目的基因的研究。

外植体消毒和预处理

将大豆种子表面消毒，常用的消毒剂有次氯酸钠溶液、溶液等。消毒后，在无菌条件下将种子接种于发芽培养基上，使其萌发。对于子叶节外植体，在种子萌发至合适天数（一般为 4 - 6 天）后，切取带有子叶节的部分，去除顶芽和侧芽，在伤口处形成农杆菌侵染的位点。对于下胚轴外植体，在种子萌发后，切取合适长度的下胚轴进行后续处理。预处理可以包括在侵染前将外植体在含有特定激素或化学物质的溶液中浸泡一定时间，以提高其对农杆菌的敏感性和再生能力。

（三）农杆菌侵染条件的优化

农杆菌培养与菌液制备

将含有目的基因载体的农杆菌菌株接种于含有相应抗生素的液体培养基中，在合适的温度（如 28℃）和转速（如 200rpm）下振荡培养至对数生长期。然后，离心收集农杆菌，用侵染缓冲液（如 MS 液体培养基添加一定浓度的乙酰丁香酮等诱导物质）重悬至合适的浓度（OD₆₀₀值一般在 0.5 - 1.0 之间）。乙酰丁香酮可以诱导农杆菌 Vir 基因的表达，增强其侵染能力。

侵染时间和方式

侵染时间对转化效率有显著影响。对于大豆子叶节外植体，侵染时间通常在 15 - 30 分钟之间。侵染方式可以采用浸泡法，即将外植体浸泡在农杆菌菌液中，同时可辅以轻微振荡，使农杆菌与外植体充分接触。也可以采用共培养法，将农杆菌与外植体在含有滤纸的共培养培养基上共同培养一段时间，这种方法可以使农杆菌更均匀地附着在外植体表面。

（四）共培养与恢复培养

共培养

侵染后的外植体转移至共培养培养基上进行共培养。共培养培养基含有适宜的植物激素和营养成分，为农杆菌与大豆外植体的相互作用提供条件。共培养温度一般为 22 - 25℃，时间为 2 - 3 天。在共培养过程中，农杆菌将 T - DNA 转移到大豆外植体细胞中。

恢复培养

共培养结束后，将外植体转移至含有抗生素的恢复培养基上，以抑制农杆菌的过度生长，同时使外植体从侵染和共培养过程中恢复。恢复培养基中的抗生素浓度需要经过优化，既要有效抑制农杆菌，又不能对大豆外植体造成过度伤害。恢复培养时间一般为 3 - 7 天，在此期间，外植体开始启动再生过程。

（五）筛选与再生培养

筛选培养

将恢复培养后的外植体转移至筛选培养基上，筛选培养基中含有选择标记基因对应的筛选剂（如草铵膦或卡那霉素）。只有成功整合目的基因和选择标记基因的细胞能够在筛选培养基上生长，未转化的细胞则会死亡。筛选培养需要持续数周，期间定期更换培养基，观察外植体的生长情况。

再生培养

在筛选培养过程中，存活的外植体细胞开始分化和再生。通过调整培养基中的植物激素种类和浓度，促进不定芽的形成和生长。例如，添加适量的细胞分裂素（如 6 - BA）和生长素（如 NAA）可以调节芽和根的发育。当不定芽长到一定高度后，将其切下并转移至生根培养基上，诱导生根，最终形成完整的转基因大豆植株。

（六）转基因大豆植株的鉴定

分子生物学鉴定

PCR 检测：提取转基因大豆植株的基因组 DNA，利用针对目的基因设计的特异性引物进行 PCR 扩增。如果扩增出与目的基因大小相符的条带，则初步表明目的基因已整合到大豆基因组中。

Southern blotting 检测：该方法可以确定目的基因在大豆基因组中的拷贝数和整合情况。将大豆基因组 DNA 进行酶切、电泳、转膜后，用标记的目的基因探针进行杂交，通过检测杂交信号来分析基因整合情况。

Northern blotting 检测：用于检测目的基因在转录水平的表达情况。提取大豆植株的总 RNA，进行电泳、转膜后，用标记的目的基因探针进行杂交，了解目的基因是否转录。

实时定量 PCR（qPCR）检测：可以定量分析目的基因在转基因大豆中的表达水平，通过与内参基因对比，准确测定目的基因的相对表达量。

表型鉴定

观察转基因大豆植株的表型变化，如抗虫转基因大豆是否对目标害虫具有抗性，抗逆转基因大豆是否在相应逆境条件（如干旱、高盐等）下表现出更好的耐受性，品质改良转基因大豆是否在种子蛋白含量、油脂成分等方面有预期的改变。同时，还可以通过生理生化指标的测定，如测定酶活性、代谢产物含量等，进一步评估转基因大豆的性状变化。

四、影响农杆菌介导大豆转基因效率的因素

（一）大豆基因型

不同大豆基因型对农杆菌侵染的敏感性和再生能力差异很大。一些大豆品种具有较好的再生体系，对农杆菌介导的转化反应良好，而另一些品种则很难获得转基因植株。这可能与不同基因型大豆的细胞壁结构、细胞内防御机制以及基因表达调控模式等因素有关。

（二）农杆菌菌株和载体因素

如前所述，农杆菌菌株的 Vir 基因活性、载体的结构和组成都会影响转化效率。此外，载体上目的基因的大小、序列特征以及与其他元件的相互作用也可能对 T - DNA 的转移和整合产生影响。

（三）侵染和共培养条件

侵染时农杆菌的浓度、侵染时间、共培养温度和时间等条件的微小变化都可能导致转化效率的显著改变。合适的侵染和共培养条件需要根据大豆品种、农杆菌菌株和载体等因素进行优化。

（四）筛选和再生条件

筛选剂的种类和浓度选择不当可能导致假阳性或假阴性结果，影响转基因植株的筛选效率。再生培养基中的植物激素种类、浓度和比例对于外植体的再生能力至关重要，不合适的激素条件可能阻碍转基因植株的形成。

五、农杆菌介导大豆转基因技术面临的挑战

（一）转化效率有待提高

尽管经过多年研究和优化，大豆的农杆菌介导转化效率仍然相对较低，尤其是对于一些优良的商业大豆品种。提高转化效率仍然是该领域的重要研究目标之一。

（二）基因沉默问题

在转基因大豆中，有时会出现目的基因沉默现象，即目的基因虽然已经整合到基因组中，但在转录或转录后水平上表达受到抑制。这可能与基因整合位点、DNA 甲基化等因素有关，影响了转基因大豆的性状表现和功能研究。

（三）生物安全问题

转基因大豆的大规模种植可能对生态环境和人类健康产生潜在影响。需要严格评估转基因大豆的安全性，包括对非靶标生物的影响、基因漂移风险以及食品安全性等方面，以确保其可持续发展。

六、农杆菌介导大豆转基因的应用前景

（一）大豆功能基因组研究

通过农杆菌介导法将特定基因导入大豆，可以研究这些基因在大豆生长发育、代谢调控等过程中的功能。例如，通过过表达或敲除某些基因，分析其对大豆产量、品质、抗逆性等性状的影响，从而深入了解大豆的分子生物学机制。

（二）大豆遗传改良

将具有优良农艺性状的基因导入大豆，培育出抗虫、抗病、抗逆和优质的大豆新品种。例如，导入 Bt 基因可以提高大豆对鳞翅目害虫的抗性，导入耐盐相关基因可以增强大豆在盐碱地的种植适应性，为保障大豆产量和满足不同领域的需求提供支持。

（三）大豆生物反应器

利用大豆作为生物反应器生产具有药用价值或工业价值的蛋白质和次生代谢产物。通过农杆菌介导法将相关基因导入大豆，使大豆能够高效合成目标产物，实现可持续的生物产品生产。

七、结论

农杆菌介导法在大豆转基因中具有重要的应用价值，通过对其原理、实验流程、影响因素、面临挑战和应用前景的深入研究，我们可以不断优化该技术，提高大豆转基因效率和质量。尽管目前还存在一些问题，但随着生物技术的不断发展，农杆菌介导的大豆转基因技术有望在大豆遗传改良、功能基因组研究和生物反应器等领域发挥更大的作用，为大豆产业的发展和农业可持续发展提供有力支持。在未来的研究中，需要进一步深入探索提高转化效率、解决基因沉默问题和确保生物安全的方法，以充分发挥农杆菌介导大豆转基因技术的潜力。