咨询热线

15614103871

当前位置:首页  >  技术文章  >  新型量子点标记核酸探针制备与原位杂交

新型量子点标记核酸探针制备与原位杂交

更新时间:2024-11-19      点击次数:161

一、引言


在现代生物医学研究中,核酸检测技术是理解基因功能、诊断疾病以及研究病原体的核心手段之一。原位杂交(ISH)作为一种重要的核酸检测方法,能够在细胞或组织水平上对特定的核酸序列进行定位和定量分析。传统的原位杂交技术往往依赖于放射性或荧光标记的核酸探针,但这些方法存在一些局限性,如放射性物质的危害、荧光标记的光稳定性差和灵敏度不足等问题。


量子点(QDs)作为一种新型的纳米材料,具有更好的光学性质,如宽激发光谱、窄发射光谱、高量子产率和良好的光稳定性。这些特性使得量子点在生物标记领域具有巨大的应用潜力。将量子点应用于核酸探针标记并用于原位杂交,有望克服传统标记方法的不足,提高检测的灵敏度和准确性。近年来,虽然在量子点标记核酸探针方面已经取得了一些进展,但仍存在许多挑战,例如量子点与核酸的高效偶联、标记后探针的稳定性以及杂交条件的优化等。因此,本研究旨在开发一种新型的量子点标记核酸探针制备方法,并优化其在原位杂交中的应用,以满足生物医学研究日益增长的需求。

二、量子点的选择与性质

(一)量子点的类型


目前,常见的量子点包括 CdSe、CdS、ZnSe、InP 等。其中,CdSe 量子点由于其优异的光学性能,如在可见光范围内具有可调节的发射波长和较高的量子产率,是本研究的主要选择对象。然而,考虑到 Cd 元素的生物毒性,在实际应用中需要对其进行适当的表面修饰以降低毒性。

(二)量子点的光学性质


量子点的光学性质与其尺寸密切相关。通过改变量子点的粒径,可以实现从紫外到红外的连续可调的发射光谱。这种特性使得可以选择不同发射波长的量子点同时标记多种核酸探针,实现多靶点的同时检测。此外,量子点的宽激发光谱允许使用单一激发光源激发多种不同发射波长的量子点,大大简化了检测系统。

三、核酸探针的设计与选择

(一)核酸探针类型


根据检测目标的不同,可以选择不同类型的核酸探针,如 DNA 探针、RNA 探针和寡核苷酸探针等。对于基因表达分析,通常选择与目标 mRNA 互补的 RNA 探针或寡核苷酸探针。在病原体检测中,针对病原体特异性基因序列设计的 DNA 探针是常用的选择。本研究中,我们根据具体的实验目的设计了一系列特异性的寡核苷酸探针。

(二)探针长度与特异性


探针的长度对其特异性和杂交效率有重要影响。一般来说,较长的探针具有更高的特异性,但杂交速度较慢;较短的探针杂交速度快,但特异性可能降低。因此,需要根据目标序列的复杂性和检测要求,优化探针的长度。在我们的实验中,通过生物信息学分析和实验验证,确定了长度在 20 - 30 个碱基的寡核苷酸探针,在保证特异性的同时具有较好的杂交效率。

四、量子点标记核酸探针的制备方法

(一)量子点的表面修饰


为了实现量子点与核酸的有效偶联,首先需要对量子点进行表面修饰。常用的表面修饰方法包括使用巯基化合物、聚乙二醇(PEG)等。我们采用了巯基 - PEG 共聚物对 CdSe 量子点进行表面修饰。这种修饰不仅可以提高量子点的水溶性和生物相容性,还可以提供活性基团用于后续的偶联反应。具体步骤如下:


  1. 将 CdSe 量子点分散在有机溶剂中,如氯仿。

  2. 加入适量的巯基 - PEG 共聚物,在超声条件下反应数小时。

  3. 通过透析或超滤等方法去除未反应的巯基 - PEG 共聚物和有机溶剂,得到水溶性的表面修饰量子点。

(二)量子点与核酸的偶联


经过表面修饰的量子点可以通过多种化学方法与核酸探针进行偶联。我们采用了戊二醛交联法,其步骤如下:


  1. 将表面修饰的量子点溶液与核酸探针溶液混合,加入适量的戊二醛溶液。

  2. 在一定的温度和 pH 条件下反应数小时,使量子点表面的活性基团与核酸探针上的氨基通过戊二醛形成共价键。

  3. 通过凝胶过滤色谱或离心等方法去除未偶联的量子点和戊二醛,得到量子点标记的核酸探针。

五、原位杂交实验

(一)样本制备


  1. 细胞样本
    对于细胞样本,我们采用常规的细胞培养方法培养目标细胞,如 HeLa 细胞。在细胞生长至适当密度后,进行固定处理。常用的固定剂包括多聚甲醛、甲醇 - 醋酸等。我们选择 4% 多聚甲醛固定细胞 15 - 20 分钟,然后用 PBS 缓冲液洗涤多次,以去除多余的固定剂。

  2. 组织样本
    组织样本取自实验动物,如小鼠。将组织块迅速冷冻后,进行切片处理,切片厚度一般为 5 - 10μm。切片在空气中干燥后,同样用 4% 多聚甲醛固定,后续用 PBS 洗涤。

(二)杂交前处理


  1. 通透处理
    为了使探针能够进入细胞或组织内部与目标核酸序列杂交,需要对样本进行通透处理。对于细胞样本,我们使用 0.5% Triton X - 100 溶液处理 10 - 15 分钟。对于组织切片,可以适当延长通透时间至 20 - 30 分钟。

  2. 预杂交
    在杂交之前,进行预杂交处理以减少非特异性杂交。将样本浸泡在含有非特异性核酸(如鲑鱼精 DNA)和封闭剂(如牛血清白蛋白)的杂交缓冲液中,在一定温度下孵育 30 - 60 分钟。

(三)杂交反应


将制备好的量子点标记核酸探针加入到杂交缓冲液中,然后将杂交缓冲液滴加到样本上,覆盖上盖玻片。在适宜的温度下(根据探针和目标序列的性质确定,一般在 37 - 65°C 之间)进行杂交反应,反应时间根据探针浓度和目标核酸的丰度而定,一般为 2 - 16 小时。

(四)杂交后洗涤


杂交后,需要进行严格的洗涤以去除未杂交的探针。采用逐步降低盐浓度的洗涤缓冲液进行洗涤,如先用高盐缓冲液(如 2×SSC)洗涤,然后逐渐降低到低盐缓冲液(如 0.1×SSC),同时可以适当提高洗涤温度,以提高洗涤效果。

(五)检测与分析


  1. 荧光显微镜观察
    由于量子点具有荧光特性,杂交后的样本可以直接在荧光显微镜下观察。通过选择合适的滤光片,可以激发量子点并检测其发射的荧光,从而观察到目标核酸在细胞或组织中的分布情况。同时,可以使用图像分析软件对荧光信号进行定量分析,以评估目标核酸的表达水平。

  2. 共聚焦显微镜分析
    对于需要更高分辨率的观察,可以使用共聚焦显微镜。共聚焦显微镜可以对样本进行断层扫描,获得更清晰的三维图像,有助于准确分析目标核酸在细胞内的定位。

六、实验结果与讨论

(一)量子点标记效率


通过紫外 - 可见吸收光谱和荧光光谱分析,我们发现量子点与核酸探针的偶联效率较高,大部分量子点成功标记上了核酸探针。这主要得益于表面修饰和偶联方法的优化,使得量子点与核酸之间形成了稳定的共价键。

(二)杂交特异性


在原位杂交实验中,我们设置了阳性对照组(含有目标核酸序列的样本)和阴性对照组(不含有目标核酸序列的样本)。结果显示,阳性对照组在预期位置出现明显的荧光信号,而阴性对照组几乎没有荧光信号,表明我们制备的量子点标记核酸探针具有较高的杂交特异性。这归因于探针设计的合理性和严格的杂交条件控制。

(三)灵敏度分析


通过对不同浓度的目标核酸样本进行杂交实验,我们发现量子点标记核酸探针的检测灵敏度明显高于传统的荧光标记探针。即使在目标核酸浓度较低的情况下,仍然能够检测到清晰的荧光信号,这主要是由于量子点的高量子产率和光稳定性,使得微弱的杂交信号也能够被有效检测。

(四)稳定性研究


对标记后的探针进行长期保存实验,发现在合适的缓冲液和保存条件下,量子点标记核酸探针在数周内仍保持较好的稳定性,荧光性能没有明显下降。这为其实际应用提供了便利,减少了探针频繁制备的麻烦。

七、结论


本文成功开发了一种新型的量子点标记核酸探针制备方法,并将其应用于原位杂交技术。通过对量子点的选择、表面修饰、核酸探针设计和偶联方法的优化,以及对原位杂交实验条件的精细调控,获得了具有高灵敏度、高特异性和良好稳定性的量子点标记核酸探针。这些探针在细胞和组织样本的核酸检测中表现出优异的性能,为生物医学研究中的基因表达分析、病原体检测等领域提供了一种强大的新工具。未来的研究可以进一步探索量子点标记核酸探针在多色成像和活体检测等更复杂应用场景中的潜力,推动生物医学诊断和研究向更高水平发展。