摘要：热纤梭菌作为一种具有重要工业应用潜力的嗜热厌氧菌，能够高效降解木质纤维素生产生物燃料及高附加值化学品。然而，其遗传转化效率长期以来限制了基因工程改造及相关生物技术应用的发展。本研究聚焦于攻克这一难题，通过系统性优化电转化参数、构建新型载体系统以及预处理细胞等创新手段，显著提高了热纤梭菌的电转化效率。详细阐述了各实验环节与优化策略，旨在为热纤梭菌及其他嗜热厌氧菌的基础研究与工业应用提供可借鉴的高效遗传转化技术路径，推动该领域生物技术进程。
随着全球对可再生能源及可持续生物制品需求的持续攀升，木质纤维素类生物质作为地球上最为丰富的可再生资源之一，其高效转化利用备受瞩目。热纤梭菌（Clostridium thermocellum）凭借其更好的纤维素酶复合体（cellulosome），可直接高效降解结晶纤维素生成乙醇、有机酸等产物，在第二代生物燃料生产及绿色化工领域展现出广阔前景。
然而，热纤梭菌基因工程操作面临重重挑战，不可缺失便是低效的遗传转化效率。传统的化学转化法在该嗜热厌氧菌中几乎无效，电转化虽有应用但效率远低于常见模式菌株，严重制约了通过基因编辑精准调控代谢途径、强化底物利用能力与产物合成效率等工作开展。深入挖掘影响电转化效率因素、探索创新策略优化转化流程，对解锁热纤梭菌巨大生物技术潜力、拓展木质纤维素生物炼制产业意义深远，也为其他嗜热厌氧微生物遗传改造提供参考范例，故而开展本项研究必要性与迫切性。
热纤梭菌野生型菌株购自标准菌种保藏中心，经活化、传代培养后用于实验。构建系列携带不同抗性标记（如红霉素、氯霉素抗性基因）、具有不同复制原点特性且含绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的穿梭质粒，用于转化评估与转化子筛选监测。
基础培养基依据热纤梭菌嗜热、厌氧且偏好木质纤维素水解物营养需求设计，以纤维素为碳源，添加适量氮源（如蛋白胨、酵母提取物）、无机盐（含镁、铁、锰等微量元素），调节 pH 至 7.0 - 7.2 后高压灭菌。厌氧培养在充入氮气、二氧化碳混合气（80:20）的厌氧工作站中，37℃静置培养，定期监测菌株生长 OD 值。
细胞生长阶段把控：设置不同转接时间、培养时长梯度，在对数前期、对数中期、对数后期分别收集细胞进行电转化，通过测定转化子数量评估最佳收获时期，利用流式细胞术监测此时细胞活力、膜通透性等生理状态指标辅助判断。
电击缓冲液配方改良：基于传统电击缓冲液（如磷酸钾缓冲液），尝试添加不同浓度的甘油、蔗糖、聚乙二醇等保护剂，调整缓冲液离子强度（改变钾、钠离子浓度），经电击后观察细胞存活率及转化效率变化，筛选合适缓冲液配方。
电转化参数精细调整：运用不同规格电转杯（0.1 cm、0.2 cm 电极间距），设置多组电压（1000 - 3000 V）、电容（25 - 100 μF）、电阻（200 - 800 Ω）组合，以电击脉冲时间、脉冲次数为变量，系统考察电脉冲对细胞摄取外源 DNA 影响，确定电转化核心参数。
细胞壁弱化处理：在收获细胞前，用适量溶菌酶、木瓜蛋白酶在温和条件下短时间处理细胞，酶解部分细胞壁肽聚糖成分，经洗涤去除酶后电转化，对比处理与未处理组转化效率，优化酶浓度、处理时间。
膜透性增强操作：利用低浓度二甲基亚砜（DMSO）、乙二胺四乙酸（EDTA）孵育细胞，借助 DMSO 改变细胞膜脂质流动性、EDTA 螯合膜表面金属离子破坏膜结构稳定性，摸索最佳孵育浓度与时长，提升外源 DNA 进入胞内效率。
电转化后菌液涂布于含对应抗性抗生素的固体培养基，37℃厌氧培养 2 - 3 天，挑取疑似转化子单菌落，经 PCR 扩增验证抗性基因、GFP 基因整合情况，荧光显微镜观测 GFP 表达确认转化成功且具活性，对稳定遗传转化子传代培养监测遗传稳定性。
实验数据表明，处于对数中期的热纤梭菌细胞在电转化中表现良好，其转化子数量比对数前期、后期分别高出约 30% 与 50%。此时细胞活力达峰值，膜通透性适中利于 DNA 结合摄入，流式细胞分析显示该阶段细胞膜完整性与细胞内物质均匀分布协同促成高效转化基础。
改良缓冲液（含 10% 甘油、0.5 M 蔗糖、50 mM 磷酸钾，pH 7.0）使电转化后细胞存活率提升 2 倍以上，转化效率相对传统缓冲液提高约 1.5 倍，甘油与蔗糖协同维持细胞渗透压、减少电击损伤，优化离子浓度保障电脉冲传递与 DNA 溶解环境稳定。
在 0.2 cm 电转杯、2500 V 电压、50 μF 电容、600 Ω 电阻，单次脉冲时长 5 - 8 ms 条件下，获得最高转化效率，较初始参数组提升近 4 倍，合理电脉冲参数确保足够电场力驱动 DNA 穿透细胞膜且避免过度损伤细胞。
溶菌酶（0.2 mg/mL 处理 30 min）联合 1% DMSO 孵育 15 min 预处理后，转化效率飙升至未经处理组 5 倍多，细胞壁适度酶解与膜透性增强 “双管齐下"，极大降低外源 DNA 进入细胞壁垒，为高效转化筑牢根基。
筛选转化子经多代培养，PCR 扩增条带稳定、GFP 持续表达，遗传稳定性良好，为后续基因功能研究、菌株工程改造长期应用奠定坚实基础。
本研究创新方法多维度攻克热纤梭菌电转化难题，各优化环节相辅相成。从细胞生理状态把握到转化微环境精细调控，再到细胞结构预处理，整合提升转化效率超 10 倍，达目前同类研究较高水平。未来工作将聚焦构建大容量基因文库、开展多基因协同编辑，进一步挖掘热纤梭菌代谢潜能，拓展木质纤维素价值转化边界，助力生物能源与绿色化工产业革新升级，也为嗜热厌氧菌遗传操作领域注入新活力、开拓新路径。
综合优化细胞培养、电击缓冲液、电转化参数及细胞预处理等要素，建立一套高效热纤梭菌电转化方法，显著改善遗传转化困境，为该菌株功能基因组学研究、代谢工程改造开辟坦途，为生物质能源与生物制品可持续生产提供关键技术支撑，预期在工业生物技术领域催生系列创新应用成果。
