小麦(Triticum aestivum L.)作为世界三大粮食作物之一,保障其产量稳定与品质提升对全球粮食安全至关重要。传统小麦育种手段在应对复杂环境胁迫、快速改良品质性状时面临诸多局限,如育种周期冗长、遗传资源利用受限等。基因工程技术的兴起为打破这些瓶颈带来曙光,可精准导入有益外源基因,定向改变小麦遗传特性。
花粉介导转化因能避开繁琐组织培养再生障碍、直接获得转基因种子,成为小麦转基因研究热点。电穿孔转化法作为花粉转化途径之一,利用短暂高压电脉冲使细胞膜通透性瞬时增加,促使外源 DNA 进入细胞。然而,当前该方法在小麦应用中转化效率参差不齐、鉴定流程欠规范,限制其广泛应用与深入发展。开展优化小麦花粉电穿孔转化并精准鉴定转基因植株研究,对完善小麦转基因技术、加速遗传改良进程理论与实践价值。
选用我国广泛种植、综合性状优良但在抗病或抗逆方面有待提升的小麦品种,如 “济麦 22"“郑麦 9023" 等,于温室或田间常规种植管理,保障花粉发育良好、活性充沛,为转化实验提供优质材料。
外源 DNA:依据研究目标(如增强抗病性导入抗病基因、提升耐盐性引入耐盐相关基因等),人工构建含目标基因、强启动子(如 CaMV 35S)、终止子的植物表达载体,经大量提取、纯化与定量,确保纯度超 90%、浓度精确可控。
电穿孔缓冲液:优化配方含适宜浓度甘露醇(维持渗透压、稳定花粉形态)、CaCl₂(助细胞膜修复、促进 DNA 结合)、MES(缓冲 pH),pH 调至 6.0 - 6.5,经 0.22μm 滤膜除菌备用。
分子鉴定试剂:Taq DNA 聚合酶、dNTPs、限制性内切酶、DNA 连接酶、DNA Marker、探针制备相关材料(放射性同位素标记物等)及杂交缓冲液、洗涤液等,均购自生物试剂公司且严格质检。
电穿孔仪(具备精准调控电压、电容、脉冲次数及时长功能,误差<1%)、离心机(高速冷冻型,最大转速>15000rpm,温控精度 ±1℃)、PCR 仪(多通道、梯度控温,控温精度 ±0.1℃)、凝胶成像系统(高分辨率、灵敏检测微量 DNA 条带)、核酸杂交仪(精确控温、振荡,保障杂交高效均匀)等,定期校准维护确保性能稳定可靠。
花粉采集与预处理:于小麦盛花期晴天上午 9 - 11 时,选取健康麦穗,轻敲收集花粉至预冷离心管,经低速离心(500 - 800rpm,5min)去除杂质。将花粉重悬于预冷电穿孔缓冲液,添加适量蛋白酶抑制剂防蛋白降解,4℃孵育 30 - 60min,优化细胞膜状态提升转化敏感性。
电穿孔转化操作:吸取预处理花粉悬液与等体积适量外源 DNA 溶液(浓度 100 - 300ng/μL)轻柔混匀,移至电穿孔杯(电极间距 0.2 - 0.4cm),置于冰浴。设置电穿孔参数(电压范围 500 - 1500V,电容 5 - 20μF,脉冲时长 10 - 50ms,脉冲次数 1 - 3 次),多梯度组合优化,按设定参数电击后冰浴静置 10 - 15min,助细胞膜恢复、稳定外源 DNA。
转化后培养与筛选:电穿孔处理花粉用新鲜电穿孔缓冲液洗涤 2 - 3 次去除残余未进入 DNA,重悬后滴加至含特定筛选剂(如潮霉素、草甘膦对应抗性基因转化体)培养基,铺板培养,25℃、弱光(1000 - 1500lux)保湿培养,定期观察筛选抗性愈伤或花粉管萌发个体,移栽入土生长。
PCR 检测:提取疑似转基因植株叶片基因组 DNA,设计跨目标基因与小麦基因组整合位点特异性引物,PCR 扩增(预变性 94℃ 5min;94℃ 30s,55 - 60℃ 30s,72℃ 1 - 2min,30 - 35 个循环;72℃ 10min),凝胶电泳检测,有条带初步判定含目标基因片段。
Southern blot 鉴定:基因组 DNA 酶切、电泳分离、转膜,放射性标记目标基因探针杂交,洗膜后化学发光或放射自显影,依杂交条带位置、强度确认基因拷贝数、整合完整性,排除非特异性扩增干扰。
Northern blot 分析:提取植株 RNA 反转录成 cDNA,电泳、转膜,用基因特异性探针杂交,检测外源基因转录表达水平,结合表型关联分析功能实现程度。
表型观测与田间验证:从株高、分蘖数、抗病抗逆表现、产量构成等多性状监测转基因株系全生育期表现,与非转基因对照对比,多季多点田间种植评估稳定性、适应性,明确改良实效。
经多组电穿孔参数实验,发现电压 1000 - 1200V、电容 10 - 15μF、脉冲时长 30 - 40ms、脉冲次数 2 次组合下,花粉活力虽稍有降低(约 80%,对照 90%),但转化效率显著提升,经抗性筛选后阳性愈伤率达 5% - 8%,较常规参数组合(<2%)优势明显,高电压助 DNA 穿透,合理电容、时长与次数协同保障细胞膜适度损伤与修复,促 DNA 整合。
蛋白酶抑制剂加持的 4℃孵育预处理,花粉细胞膜完整性提升,电穿孔后膜修复加快,外源 DNA 摄取量增多,荧光定量 PCR 测转化花粉目标基因初始拷贝数较未处理高 2 - 3 倍,对应后续抗性筛选植株阳性率提升约 30%,证实预处理优化对转化有积极增效。
PCR 检测初筛得阳性植株比率约 10% - 15%,经 Southern blot 精准鉴定,约 70% - 80% 具清晰、特异杂交条带,确定外源基因整合,单拷贝整合占比约 40%,多拷贝整合分布规律明晰;Northern blot 显示整合基因在多数阳性株转录正常,表达量与拷贝数有一定正相关,且抗病或抗逆相关转基因株系对应性状测试优于对照,如耐盐株系 0.5% NaCl 胁迫下根长、生物量比对照高 30% - 50%,表型与分子表达关联紧密,验证转化与表达实效性。
本研究成功优化小麦花粉电穿孔转化流程,关键在于精细电穿孔参数匹配与花粉预处理强化,协同打破转化瓶颈。在鉴定层面,多技术联用、层层递进,从基因有无、拷贝数到转录表达、表型功能全方面解析,保障转基因株系精准甄别,解决以往鉴定单一、误判率高问题。
与传统农杆菌介导、基因枪转化比,花粉电穿孔简化流程、降低设备依赖与成本,虽仍有花粉活力损失、转化效率待升空间,但经优化后差距缩小且适用特殊基因导入场景。后续可深挖电穿孔微观机制、拓展适配基因类型,结合基因编辑技术,为小麦复杂性状改良定制方案,持续赋能小麦遗传育种革新。
本研究系统优化小麦花粉电穿孔转化方法,确定最佳电穿孔参数与花粉预处理条件,显著提高转化效率,结合严谨分子与表型鉴定体系,精准筛选、确认转基因植株,为小麦功能基因挖掘、品种定向改良筑牢技术根基,预期未来在小麦优质高产抗逆育种实践中发挥关键支撑,推动产业高质量发展。