外源基因转染细胞技术作为现代生物学与医学研究的关键工具，历经多年发展取得了丰硕成果。本综述系统阐述了该技术的研究现状，涵盖物理、化学、生物三大类转染方法，深入剖析各类方法的原理、优势与局限性；详细探讨转染效率、细胞毒性、基因表达稳定性等核心评价指标；并聚焦新兴技术如纳米材料介导、CRISPR-Cas 系统辅助转染的前沿进展。旨在为科研人员精准选择适配的转染策略、攻克现存技术瓶颈，及推动跨学科研究应用提供全面、前沿且具深度的专业参考。
在生命科学蓬勃发展的当下，探究基因功能、构建疾病模型、研发基因治疗方案等诸多关键研究领域，均离不开外源基因转染细胞技术。这一技术宛如一座桥梁，跨越了外源遗传物质与靶细胞之间的天然屏障，使得人为操控细胞基因表达成为可能，进而解锁众多生命奥秘，为攻克疑难病症开辟崭新路径。
自上世纪 70 年代基因转染技术雏形初现，历经数十年探索，科研人员从早期借助病毒天然感染机制，逐步拓展至融合物理学、化学多学科原理创新转染手段，成果斐然却也挑战重重。当下，如何在确保高效转染的同时降低细胞毒性、精准调控转染后基因表达时空特性，依旧是亟待攻克的前沿课题。本文将全方面梳理外源基因转染细胞技术的发展脉络、详述主流技术细节、剖析前沿突破，以期为学界同仁呈上一份详实且具启发性的技术指南。
电穿孔技术基于细胞膜在高强度电场作用下瞬间形成可逆性微孔这一更好电学特性。当向细胞悬液施加特定脉冲电场，通常电场强度维持在 100 - 1000 V/cm、脉冲持续时间为微秒至毫秒级，细胞膜磷脂双分子层结构紊乱，孔隙应运而生，外源 DNA、RNA 等遗传物质顺势经孔隙扩散入胞内。
在实验操作层面，科研人员先将靶细胞轻柔重悬于预冷的电转缓冲液，缓冲液成分经精细调配以维持细胞渗透压与离子稳态；精准调控细胞密度至适宜范围，一般哺乳动物细胞浓度为 1×10⁶ - 1×10⁷ 个 /mL。随后按一定比例混入待转染核酸，转移至特制电转杯，安置于电穿孔仪电极间。依细胞类型差异微调电穿孔参数，例如转染小鼠胚胎干细胞，电场强度设为 800 V/cm、脉冲时长 30 ms，重复电击 2 - 3 次，确保核酸足量摄入细胞，操作全程严格把控温度、避免气泡生成，以防细胞受损。
显微注射堪称细胞基因转染领域的 “精密外科手术"。在高倍倒置显微镜辅助下，借助纤细玻璃微针（直径常小于 1 μm），研究人员手动将外源基因溶液精准注入单个细胞胞质或细胞核。这一技术优势显著，转染物质剂量精准可控，近乎无核酸降解风险，基因递送效率出众；然而技术门槛颇高，对操作人员熟练度、仪器精密度要求苛刻，通量极低，仅适用于少量珍贵细胞样本，如胚胎干细胞早期发育研究、转基因动物模型构建初期细胞操作。
实际操作时，需先运用拉针仪精心制备微针，经煅烧、打磨确保针尖顺滑锐利；固定细胞于显微操作台上，借助负压轻柔吸附细胞，操控微针缓慢刺入预定细胞区室，以皮升级微量注射器精准推送核酸溶液，注射体积常严控在 1 - 10 pL，过程需全程监测细胞形态，损伤引发细胞裂解。
脂质体转染是实验室应用最为广泛的化学转染手段之一，核心原理是阳离子脂质体与带负电核酸分子借静电引力自发组装成复合物。阳离子脂质头部亲和核酸磷酸基团，疏水尾部相互靠拢，包裹核酸形成纳米级脂质微粒；该微粒凭借脂质成分与细胞膜脂质相似相溶特性，融合细胞膜，将核酸释放至胞内。
实验流程起始于脂质体与核酸按特定质量比（依细胞、核酸种类微调，常见 1:1 - 3:1）室温孵育 15 - 30 分钟，促使复合物稳定成型；转染前细胞换用无血清培养基，旨在降低血清蛋白对外源复合物干扰；轻柔滴加复合物至细胞培养皿，置于 37°C、5% CO₂孵箱孵育 2 - 6 小时后，补加含血清培养基继续培养。以人肾上皮细胞 HEK293T 转染荧光报告基因实验为例，脂质体 2000 与质粒 DNA 按 2:1 配比，转染 4 小时后荧光显微镜下可见显著绿色荧光蛋白表达，转染效率超 50%，但部分细胞因脂质累积现轻微毒性表征。
磷酸钙共沉淀法巧妙利用了磷酸钙在生理条件下形成沉淀裹挟核酸沉淀至细胞表面，借细胞内吞机制摄取外源基因。实验时，将氯化钙溶液与含核酸磷酸缓冲液缓慢混合，在特定 pH（约 7.0 - 7.4）、温度（室温至 37°C）条件下孵育，促使细微磷酸钙 - 核酸共沉淀析出；均匀滴加至细胞层，孵育数小时后细胞经内吞摄取沉淀微粒实现转染。
如在小鼠成纤维细胞 NIH3T3 转染实验中，先配置 25 mM 氯化钙、2X HBS（ Hepes 缓冲盐水），将 1 - 10 μg 质粒 DNA 混入氯化钙溶液，逐滴加至等体积 2X HBS，涡旋混匀、室温静置 30 分钟形成沉淀悬液；轻柔覆盖细胞，37°C 孵育 4 - 6 小时，换液培养 24 - 48 小时后检测基因表达，转染效率约 30%，成本低廉，但沉淀颗粒不均一、重复性欠佳，易致细胞应激损伤。
病毒载体转染是基因治疗临床前研究与部分临床试验阶段倚重的高效策略。逆转录病毒、慢病毒、腺病毒等经基因工程改造，剔除致病基因，保留感染、整合宿主细胞基因组能力，将外源治疗基因精准输送、整合入靶细胞染色体特定区域。
以慢病毒载体构建及转染造血干细胞为例，科研人员先克隆目标基因至慢病毒穿梭质粒，与包装质粒共转染 293T 细胞，48 - 72 小时后收集富含重组慢病毒上清液；超速离心浓缩、过滤除菌；将造血干细胞与病毒液按感染复数（MOI）10 - 50 孵育 6 - 12 小时，借荧光标记基因监测转染效率高达 80% 以上，基因长期稳定表达，但病毒载体免疫原性、潜在致瘤风险是临床转化掣肘难题。
转染效率直观反映外源基因成功导入细胞的比例，关乎实验成败。常用检测手段涵盖荧光显微镜直接观测荧光蛋白表达、流式细胞术精准定量荧光阳性细胞比率、定量 PCR 测定转染细胞内目的基因拷贝数等。不同检测各有优劣，荧光显微镜简便直观却易受主观判断干扰；流式细胞术通量高、精度准，但仪器昂贵、样本处理繁琐；定量 PCR 灵敏度超群，可精准量化基因拷贝，却对样本纯度、操作规范性要求严苛。
细胞毒性评估旨在监测转染流程对细胞生理机能损害程度，关乎细胞存活、增殖及后续实验数据可靠性。乳酸脱氢酶（LDH）释放实验借检测细胞受损后胞内 LDH 逸出量评估膜完整性；MTT、CCK - 8 比色法通过活细胞代谢还原试剂显色深浅量化细胞活性；显微镜下观察细胞形态，如胞体肿胀、膜泡形成、核固缩等异常表征辅助判断毒性强弱。理想转染应在保障高效基因递送同时，将细胞毒性控制在低限度。
基因转染后持续、稳定表达是众多长期研究诉求，尤其在基因治疗领域。借助 Western blot 监测目的蛋白表达量动态变化、荧光素酶报告基因系统实时追踪基因转录活性，科研人员可洞悉转染基因表达时效特征；基因组 DNA 测序、Southern blot 则用于剖析外源基因整合位点、拷贝数变异，阐释表达稳定性分子机制，为优化转染策略夯实数据根基。
纳米材料家族如金纳米粒子、碳纳米管、量子点衍生纳米复合物，为基因转染注入全新活力。这些纳米级载体粒径精准可控，表面经功能基团修饰后亲和核酸、靶向细胞特异性受体，实现高效、低毒基因转运。
研究团队创新性合成聚乙二醇修饰金纳米棒 - 核酸复合物，金纳米棒更好光学特性利于实时示踪转染路径；表面 PEG 链屏蔽免疫识别、降低非特异性吸附，体内外实验显示，转染肝癌细胞效率较传统脂质体提升 30%，细胞毒性削减 50%，彰显纳米材料在肿瘤基因治疗精准递送层面巨大潜力。
CRISPR - Cas 基因编辑技术与转染技术深度融合，革新基因功能研究范式。科研人员借 CRISPR - Cas9 系统搭载 sgRNA 及外源修复模板转染细胞，精准敲除、插入或修复靶基因，实现基因原位编辑；基于 Cas13 蛋白靶向 RNA 切割活性，拓展至 RNA 编辑、调控领域。
在杜氏肌营养不良症（DMD）细胞模型构建中，将编码 Cas9、sgRNA 及正常 dystrophin 基因 cDNA 质粒共转染患者来源肌细胞，经筛选鉴定，成功修复致病基因突变、恢复肌蛋白表达，为遗传性疾病基因治疗勾勒希望曙光。
外源基因转染技术虽成果斐然，但前路漫漫。如何跨越不同细胞类型固有转染壁垒，开发普适、高效转染试剂仍是难题；降低病毒载体免疫副反应、提升纳米载体生物安全性与代谢稳定性，亟待材料学、医学多学科协同破局；转染后基因表达精准时空调控，契合生理病理进程需求，呼唤合成生物学深度介入。
展望未来，随着单细胞测序、人工智能辅助药物设计蓬勃兴起，外源基因转染技术有望迎来个性化定制时代。借助大数据精准解析细胞异质性，人工智能模拟优化转染方案，靶向递送基因、智能调控表达将不再遥远，解锁更多生命科学未知疆域，托举基因治疗临床转化愿景落地。
综上，外源基因转染细胞技术作为生命科学研究基石，正历经持续蜕变，从基础原理深耕至前沿应用拓展，每一次技术革新都为学界注入前行动力，激励科研人员勇攀生命密码解析高峰，推动生物医学阔步迈向精准、治愈新纪元。
