摘要：肝癌作为全球范围内高致死率的恶性肿瘤之一，亟待寻找新型高效的治疗策略。本研究聚焦于天然生物碱 —— 苦参碱，旨在深度探究其对人肝癌 HepG2 细胞代谢基因水平的影响。通过一系列精心设计的细胞实验，包括细胞培养、不同浓度苦参碱处理、CCK-8 检测细胞活力、实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）以及蛋白质免疫印迹（Western blot）技术，系统剖析苦参碱干预下 HepG2 细胞代谢相关基因及蛋白表达的动态变化。研究结果揭示，苦参碱可显著改变 HepG2 细胞内多条代谢通路关键基因的表达，诱导细胞周期阻滞，抑制细胞增殖，有望为肝癌临床治疗提供新颖且坚实的理论依据与潜在治疗靶点。
肝癌发病率逐年攀升，已然成为严重威胁人类生命健康的重大难题。传统的手术、放化疗手段虽取得一定成效，但副作用明显，预后效果仍不理想，促使科研界不断探寻新型抗癌药物及治疗机制。植物源天然产物因结构多样、生物活性丰富，在抗癌新药研发领域备受瞩目，苦参碱便是其中之一。
苦参碱提取自苦参等豆科植物，既往研究已初步证实其具备抗炎、抗病毒以及抗肿瘤等多重功效。然而，其针对肝癌细胞具体的作用靶点及内在分子机制，尤其是在细胞代谢基因调控层面，尚未完整明晰。细胞代谢异常堪称肿瘤细胞的显著特征，癌细胞凭借重塑代谢途径来满足快速增殖、侵袭所需的能量与物质基础。鉴于此，深入挖掘苦参碱与肝癌细胞代谢基因间的交互作用，对于阐明其抗癌活性本质、开发肝癌靶向治疗策略意义非凡。
人肝癌细胞系 HepG2 购自细胞库，于含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 DMEM 高糖培养基中，在 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱内常规培养。细胞呈对数生长期时用于后续实验。
苦参碱标准品纯度＞98%，购自专业化学试剂公司；CCK-8 检测试剂盒用于细胞活力测定；Trizol 试剂用于提取细胞总 RNA；反转录试剂盒、qRT-PCR 相关试剂用于基因表达定量；一抗、二抗及化学发光底物等用于 Western blot 检测蛋白表达，均为业内口碑良好、质量可靠的品牌产品。
实验设置空白对照组（仅含培养基）、溶剂对照组（含与最高苦参碱处理浓度等量的溶剂，确保溶剂无细胞毒性干扰）以及不同浓度苦参碱处理组，苦参碱终浓度梯度设定为 0.1 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM，每组设至少 3 个复孔，独立重复实验 3 次，确保数据可靠性与可重复性。依据前期预实验及文献调研选定浓度范围，旨在全面捕捉苦参碱剂量效应关系。
采用 CCK-8 法监测苦参碱对 HepG2 细胞增殖活力的即时影响。将处于对数生长期、状态良好且密度均匀的 HepG2 细胞，以每孔 5×10³ 个接种至 96 孔板，培养 24 h 待细胞贴壁后，更换含不同浓度苦参碱的新鲜培养基，继续孵育 24 h、48 h、72 h。各时间点孵育结束前 4 h，向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，轻晃混匀，于酶标仪 450 nm 波长处读取吸光度值（OD 值）。依公式计算细胞活力：细胞活力（%）=（实验组 OD 值 - 空白对照组 OD 值）/（溶剂对照组 OD 值 - 空白对照组 OD 值）× 100%，绘制细胞活力随时间及苦参碱浓度变化曲线。
待苦参碱处理相应时长后，弃去培养基，用预冷 PBS 漂洗细胞 2 次，按 Trizol 试剂说明书提取细胞总 RNA，经琼脂糖凝胶电泳及核酸定量仪检测 RNA 纯度、完整性与浓度，确保高质量 RNA 用于后续实验。以提取的 RNA 为模板，借助反转录试剂盒合成 cDNA 第一链，随后进行 qRT-PCR 反应。选用 GAPDH 为内参基因，针对代谢关键基因如葡萄糖转运蛋白 1（GLUT1）、己糖激酶 2（HK2）、丙酮酸激酶 M2（PKM2）、乳酸脱氢酶 A（LDHA）等设计特异性引物，引物序列经 BLAST 比对验证特异性，由专业生物公司合成。反应体系依 qRT-PCR 试剂盒标准配置，运行程序为：预变性 95℃ 30 s；变性 95℃ 5 s，退火延伸 60℃ 30 s，共 40 个循环；熔解曲线分析监测产物特异性。通过 2⁻ΔΔCt 法计算各代谢基因相对表达量，精准量化苦参碱引发的基因表达改变。
收集苦参碱处理后的 HepG2 细胞，加入适量 RIPA 裂解液（含蛋白酶、磷酸酶抑制剂）冰上裂解 30 min，高速离心收集上清获取总蛋白，用 BCA 法测定蛋白浓度。取等量蛋白样品经 SDS-PAGE 电泳分离，转至 PVDF 膜，5% 脱脂牛奶室温封闭 1 h；分别孵育对应一抗（抗 GLUT1、HK2、PKM2、LDHA 及 β-actin 等，4℃过夜），TBST 缓冲液漂洗后孵育 HRP 标记二抗（室温 1 h）；再次漂洗，用化学发光底物显影，于成像系统曝光采集条带信号，ImageJ 软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）灰度比值表征蛋白相对表达水平，直观展现苦参碱对代谢相关蛋白合成的调控作用。
CCK-8 检测结果显示，随苦参碱浓度递增及处理时间延长，HepG2 细胞活力显著下降。与空白对照组及溶剂对照组相比，0.25 mM 及以上浓度苦参碱处理 24 h 后细胞活力开始明显降低（P < 0.05）；处理 48 h、72 h 时，各浓度组细胞活力抑制效果更趋显著，1 mM 苦参碱处理 72 h 组细胞活力降至不足对照组 30%，呈现清晰剂量、时间依赖趋势，初步表明苦参碱对 HepG2 细胞增殖有强力抑制效能。
qRT-PCR 数据表明，苦参碱显著干扰 HepG2 细胞多条代谢通路关键基因转录水平。糖酵解途径中，GLUT1、HK2、PKM2、LDHA 基因表达随苦参碱浓度增加呈不同程度下调，以 1 mM 苦参碱处理组最为突出，GLUT1 基因相对表达量降至对照组 0.3 倍左右（P < 0.01），HK2、PKM2、LDHA 也有 0.4 - 0.6 倍幅度降低，暗示苦参碱能阻碍癌细胞葡萄糖摄取及酵解进程，限制能量快速生成。三羧酸循环相关基因如异柠檬酸脱氢酶（IDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）表达亦受影响，mRNA 水平有所降低，揭示苦参碱可扰乱癌细胞线粒体内正常能量代谢循环，全方面破坏细胞供能体系。
Western blot 结果与基因表达趋势基本契合，GLUT1、HK2、PKM2、LDHA 蛋白条带灰度值在苦参碱处理后显著降低，表明蛋白合成量减少。尤为关键的是，PKM2 蛋白出现亚型转换迹象，伴随高活性四聚体向低活性二聚体转变，这不仅影响糖酵解终末产物生成，还关联细胞增殖、迁移信号通路调控，凸显苦参碱多维度干预细胞代谢的复杂机制，从蛋白翻译后修饰层面深度重塑癌细胞代谢格局。
本研究精准揭示苦参碱对 HepG2 细胞代谢基因水平具有全方面、深层次调控作用，为理解其抗癌机制提供关键线索。细胞代谢重编程是癌细胞恶性表型维持根基，肝癌细胞偏好有氧糖酵解（“Warburg 效应"），即便有氧条件下也大量摄取葡萄糖，经低效酵解供能并累积代谢中间产物用于生物合成。苦参碱直击这一核心异常代谢模式，下调 GLUT1、HK2 等基因表达，从细胞膜转运、糖酵解起始关键步骤削减葡萄糖流入与利用效率，打破癌细胞能量与物质代谢平衡。
PKM2 作为糖酵解流量调控 “开关"，其亚型转换受苦参碱诱导意义重大。四聚体 PKM2 利于糖酵解终产物丙酮酸生成，维持细胞增殖；二聚体 PKM2 则 “分流" 代谢物进入合成代谢支路，且穿梭至细胞核激活癌基因转录。苦参碱促使 PKM2 二聚体增多，看似矛盾却精妙抑制癌细胞增殖：一方面削弱糖酵解产能；另一方面扰乱核内促癌信号，双管齐下遏制肝癌进展，拓展对 PKM2 功能多样性及靶向干预策略的全新认知。
三羧酸循环受损进一步佐证苦参碱系统性打击癌细胞代谢网络。IDH、SDH 基因及蛋白受抑，线粒体呼吸链电子传递受阻，氧化磷酸化产能 “短路"，细胞内 ATP 匮乏，增殖、侵袭动力骤减。此代谢紊乱连锁反应还波及氨基酸、核苷酸代谢，全方面限制癌细胞生长必需原料合成，诱导细胞周期停滞、凋亡程序启动，契合肿瘤代谢靶向治疗理念。
本研究通过严谨细胞实验确证苦参碱可显著改变 HepG2 细胞代谢基因表达谱、蛋白合成及活性，从糖酵解、三羧酸循环等关键环节阻断癌细胞代谢异常优势，抑制细胞增殖。这不仅夯实苦参碱抗癌药理基础，更勾勒出基于代谢基因靶点的肝癌治疗新路径。后续研究拟聚焦苦参碱与代谢基因启动子区互作、信号通路上下游调控细节，结合体内动物实验及临床样本验证，加速推动苦参碱从基础研究迈向肝癌临床精准治疗应用，为肝癌患者燃起新希望，助力攻克这一顽固癌症堡垒。
在未来探索征程中，苦参碱有望联合传统疗法打造个性化抗癌方案，凭借天然低毒优势规避放化疗严重副作用；还可启发新型小分子代谢调节剂研发，靶向更多肿瘤特异性代谢节点，革新癌症治疗范式，肿瘤代谢研究领域迈向新阶段，为全球癌症防治事业注入磅礴动力。临床转化之路虽布满荆棘，但本研究点亮的苦参碱抗癌之光，必将吸引学界同仁携手奋进，共同迎接肝癌治疗曙光破晓。
