摘要：基因组原位杂交（Genomic in situ hybridization，GISH）作为一种强大的细胞遗传学技术，在植物研究领域取得了诸多突破性进展。本文全面综述了 GISH 技术的近期革新要点，涵盖探针标记、杂交条件优化以及信号检测方法改良等层面。详细阐述其在植物多倍体进化分析、外源染色体鉴定、种子染色体行为研究中的具体应用实例，结合创新性实验流程，展示如何精准利用 GISH 技术剖析植物基因组结构与功能，为植物遗传育种、物种演化探究提供关键线索，助力植物学前沿研究攻克复杂的基因组学难题。
植物基因组复杂多样，蕴含丰富的遗传信息，是植物适应环境、进化演变以及性状表现的核心物质基础。解析植物基因组结构与功能关系，一直是植物学领域的重点研究方向。基因组原位杂交技术应运而生，它犹如一把精细的分子手术刀，能够直接在染色体水平上可视化特定 DNA 序列的分布与组织形式，为植物细胞遗传学研究开辟了直观、精准的路径。
早期 GISH 技术受限于探针标记效率、杂交特异性不足以及信号分辨率低等问题，应用范畴较为狭窄。但随着分子生物学、生物化学及显微镜技术的迅猛发展，GISH 迎来革新浪潮，在植物多倍体物种形成机制阐释、远缘种子育性剖析、野生种质资源渗入追踪等方面发挥不可替代的作用，逐渐成为植物科研工作者手中的得力工具。以下将深入探讨 GISH 的技术新进展及其在植物学界的多元应用实例，穿插实验操作关键环节，以期为同行提供详实技术参考与创新思路启发。
传统放射性探针标记虽灵敏度高，但操作危险、半衰期短，已逐渐被非放射性标记取代。荧光素标记成为主流趋势，如 Cy3、Cy5 等荧光物质，可通过缺口平移、PCR 扩增等方式高效掺入探针 DNA 链。新型的 Click 化学标记技术崭露头角，它基于生物正交化学反应，能在温和条件下将小分子荧光标签精准连接到探针末端，显著提升标记特异性与稳定性；实验操作时，先合成含炔基或叠氮基修饰的核苷酸前体，用于探针制备，后续与荧光偶联试剂在细胞原位快速、定点反应，生成高亮度荧光信号，降低背景干扰。
缓冲液配方改进是关键一环。研发出的新型杂交缓冲液添加了去垢剂、 crowding 试剂（如葡聚糖硫酸酯），精准调控溶液离子强度、pH 值，利于探针快速、均匀地扩散至染色体靶位点，增强杂交动力学效率；操作时需精准称量各成分，严格把控缓冲液配制流程，确保每次杂交条件一致性。温度控制方面，引入智能温控设备，实现变温杂交程序，模拟生物体内 DNA 复性动态过程，初期高温促使探针快速搜寻靶序列，随后逐步降温稳定杂交双链，提高杂交成功率与信号清晰度。
超高分辨率显微镜技术大放异彩，如结构光照明显微镜（SIM）、受激辐射损耗显微镜（STED），突破传统光学衍射极限，将 GISH 信号分辨率提升至纳米级别，能精准定位染色体细微结构上的杂交位点；实验需配备专业显微镜成像系统，调整合适的激发光波长、曝光时间，捕捉微弱荧光信号。图像分析软件功能愈发强大，基于深度学习算法的软件可自动识别、量化染色体及杂交信号，减少人工误差，高效统计染色体数目、臂比及信号强度，为大规模样本分析提供便利。
多倍体化是植物进化的重要驱动力，GISH 助力解析其复杂历程。以小麦属为例，普通小麦（Triticum aestivum，六倍体）起源一直备受关注。科研团队提取野生二倍体祖先种（如节节麦、乌拉尔图小麦）基因组 DNA 制备探针，与普通小麦中期染色体玻片杂交。实验流程涵盖：精准取材小麦幼嫩根尖，卡诺氏固定液处理后解离获取高质量染色体标本；探针变性、杂交严格控温，37℃孵育过夜；严谨洗脱未结合探针，荧光显微镜下观测。结果清晰显示不同基因组来源染色体片段在普通小麦核型中的分布，证实其多轮次杂交、染色体加倍进化模式，明确祖先种基因组对小麦性状塑造贡献，为小麦遗传改良、野生种质挖掘指引方向。
在植物远缘杂交育种中，外源染色体导入是创制新材料的常用策略，GISH 可精准鉴定其归宿。在小黑麦（小麦与黑麦种子后代）培育里，用黑麦基因组总 DNA 标记探针，与小黑麦染色体杂交。操作时优化探针浓度，避免信号过强掩盖小麦染色体信号；杂交后采用多轮分步洗脱，增强小麦 - 黑麦染色体区分度。图像呈现鲜明双色荧光，准确标定黑麦染色体片段大小、位置，判定其遗传稳定性，为筛选含目标性状且染色体稳定的小黑麦株系提供关键依据，加速优质、抗逆小黑麦品种选育进程。
植物种间、属间种子常出现染色体联会异常、分离紊乱，致育性降低。GISH 实时监测种子减数分裂染色体动态。以烟草属种间种子为例，取种子花粉母细胞减数分裂前期 I 样本制片，以双亲基因组 DNA 分别标记不同荧光探针，双色 GISH 同步观察双亲染色体配对、交换情况。实验全程维持低温、高湿环境，防止样本干燥变形；巧妙调整荧光滤镜组合，同步捕捉双色信号。发现部分种子染色体存在同源区段错配、非同源联会，直观解释种子不育分子机制，为后续染色体工程操作、育性恢复策略制定提供一手资料。
植物根尖是染色体观察优质材料。上午 9 - 11 时取材，此时细胞分裂旺盛；根尖用清水洗净后，迅速浸入预冷卡诺氏固定液（无水乙醇 : 冰醋酸 = 3 : 1），4℃固定 24 小时，充分固定细胞形态与染色体结构。解离环节，用 1 mol/L 盐酸 60℃水浴处理 8 - 12 分钟，精准把控时间，避免过度解离致染色体碎片化；解离后蒸馏水漂洗 3 - 5 次，移至载玻片，轻敲分散细胞，火焰干燥制片，确保染色体平整铺展，利于后续杂交。
探针质量决定杂交成败。提取植物基因组 DNA 后，利用限制性内切酶切割成长度适宜片段（0.5 - 2 kb），便于杂交穿透；标记采用生物素、非放射性物质时，严格遵循试剂盒流程操作，控制反应体系各成分比例，如 dNTP 浓度、酶量，保证标记效率。杂交体系构建，每张玻片加 20 - 30 μL 杂交混合液（含探针、杂交缓冲液等），盖上盖玻片，周边封蜡防蒸发；置于湿盒，37℃恒温杂交 12 - 16 小时，期间维持盒内湿度稳定，保障杂交充分进行。
杂交后洗脱严谨细致，依次用不同浓度、温度 SSC 缓冲液漂洗，去除非特异性结合探针；检测生物素标记探针，用亲和素 - 荧光素复合物孵育，标记则用抗抗体 - 荧光素偶联物，室温避光反应 1 - 2 小时，减少荧光淬灭。显微镜观察荧光显微镜，暗视野下先用低倍镜锁定目标染色体区域，再切换高倍镜微调焦距、曝光时间；多色 GISH 实验依荧光素激发波长顺序采集图像，后期用专业图像软件叠加、处理，增强信号对比度、清晰度，如实还原染色体杂交图景。
基因组原位杂交技术在植物领域潜能巨大，未来有望持续突破。在技术融合方向，与单细胞测序、三代测序技术联动，整合染色体宏观结构与基因微观序列信息，全方面解析植物基因组；开发原位杂交与基因编辑实时监测体系，追踪 CRISPR/Cas 系统在染色体靶位点编辑动态，优化基因编辑流程。应用拓展层面，聚焦濒危植物，利用 GISH 揭示其更好基因组演化路径，助力保育策略制定；深度参与全球气候变化下植物适应性研究，监测关键基因、染色体片段变异，为作物抗逆育种输送理论支撑，推动植物科学迈向分子精准解析、种质创新利用新纪元。
GISH 技术革新成果斐然，从探针设计到成像解读全方面升级；在植物多倍体、杂交育种、染色体行为研究领域硕果累累，实验流程精细打磨。植物学界同仁借此可深挖植物基因组奥秘，攻克遗传育种、物种保护难关，携手在植物科学征程上扬帆远航，解锁更多未知遗传密码，培育绿色未来希望种苗。
