本研究聚焦于抗菌肽 D 基因成功植入番茄后的转基因植株精准鉴定。通过农杆菌介导转化法将抗菌肽 D 基因导入番茄，运用分子生物学与表型分析相结合的手段，全面评估转基因植株。在分子层面，借助 PCR、Southern 杂交确认基因整合，利用 RT-PCR、qRT-PCR 解析基因表达；表型上，观测植株生长发育、抗逆及抗病表现。研究结果精准判定了转基因植株，揭示抗菌肽 D 基因赋予番茄显著抗菌能力，且未引发严重生长异常，为番茄抗病育种及后续基因工程应用筑牢根基，提供详尽技术参照与理论支撑。
番茄（Solanum lycopersicum）作为全球广泛种植、经济价值斐然的蔬菜作物，产量与品质深受病原菌威胁。传统化学防治手段虽能在一定程度控制病害蔓延，但农药残留、环境污染及病原菌抗药性滋生等棘手问题接踵而至，促使科研界探寻绿色、长效病害防控策略。抗菌肽是生物免疫系统天然分泌的小分子多肽，具备广谱抗菌活性，抗菌机制更好，能迅速破坏病原菌细胞膜完整性，使其内容物外泄致死，且不易诱发微生物抗性，成为生物防治领域 “新宠"。
抗菌肽 D 经前期研究证实，对番茄常见致病真菌（如灰霉病菌、早疫病菌）、细菌（如青枯病菌）抗菌活性优良。将其基因植入番茄，有望从植株自身激发持久抗病潜能。然而，基因转化流程复杂多变，外源基因能否精准整合、稳定表达并切实增强植株抗病力，亟待系统严谨鉴定。当下，众多转基因研究因鉴定环节粗放，致实验成果可信度存疑、重复性欠佳。本研究旨在填补此空白，构建全方面、精细化鉴定体系，为番茄抗病转基因改良提供，助力农业生物技术升级。
选用商业番茄品种 “中蔬 4 号" 为受体材料，该品种适应性强、遗传背景明晰，利于精准分析基因效应；农杆菌菌株 EHA105 携带重组质粒 pBI121-AntiD，其上精确插入抗菌肽 D 基因，且配备 CaMV 35S 强启动子驱动基因表达，卡那霉素抗性基因作筛选标记。
外植体准备：取番茄种子，经 70% 酒精消毒 30 秒、0.1%浸泡 8 分钟，无菌水冲洗 5 次后，接种于 MS 基本培养基，25℃、16 小时光照 / 8 小时黑暗条件下萌发，待子叶展开、真叶初现，剪取子叶及下胚轴切段（0.5 - 1 cm）作外植体。
农杆菌侵染：挑取含重组质粒农杆菌单菌落，接种于含相应抗生素 YEB 液体培养基，28℃、200 rpm 振荡培养至 OD₆₀₀ = 0.6 - 0.8；收集菌体，用 MS 液体培养基重悬并调 OD₆₀₀至 0.4，加入乙酰丁香酮（100 μmol/L）提升转化效率。外植体浸入菌液 15 分钟，期间轻柔振荡，确保侵染均匀。
共培养与筛选再生：侵染后外植体转至铺有无菌滤纸的 MS 共培养基（含 2.0 mg/L 6 - BA、0.2 mg/L IAA），25℃暗培养 2 天促农杆菌与植物细胞互作；随后移至筛选培养基（MS + 2.0 mg/L 6 - BA + 0.2 mg/L IAA + 50 mg/L 卡那霉素 + 250 mg/L 头孢霉素），每 2 周继代，诱导抗性愈伤、芽分化；待芽长至 2 - 3 cm，切下转至生根培养基（1/2 MS + 25 mg/L 卡那霉素）促生根，获抗性植株。
PCR 检测：以抗性植株叶片 DNA 为模板，利用特异性引物扩增抗菌肽 D 基因片段（引物序列：F：5’-ATGGCCTCGTGCTGCTGCTG-3’；R：5’-TCAGGGCTCGGTGGTGGTG-3’）。PCR 反应体系 25 μL，含 1×PCR buffer、2.0 mmol/L MgCl₂、0.2 mmol/L dNTPs、0.5 μmol/L 引物、1 U Taq DNA 聚合酶及约 100 ng 模板 DNA；反应程序：94℃预变性 5 分钟；94℃变性 30 秒，58℃退火 30 秒，72℃延伸 1 分钟，35 个循环；72℃终延伸 10 分钟。产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，凝胶成像系统观察，出现约 300 bp 条带者初步判为阳性植株。
Southern 杂交：提取 PCR 阳性植株基因组 DNA，用限制性内切酶 HindⅢ 酶切过夜，使基因组 DNA 片段化；经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分离，碱变性、中和处理后，虹吸转膜至尼龙膜；以标记抗菌肽 D 基因全长探针（按 Roche 试剂盒操作），与膜杂交过夜，洗膜后用 CSPD 底物化学发光显色，X 光 胶片曝光记录，依杂交条带数目、位置判定基因拷贝数，单拷贝整合植株用于后续研究。
RT - PCR 与 qRT - PCR：取转基因及野生型番茄植株幼叶，用 TRIzol 试剂提取总 RNA，经 DNase I 消化去除残留 DNA；取 1 μg RNA 用 M - MLV 反转录酶合成 cDNA。RT - PCR 引物同 PCR 检测，内参基因选 Actin（引物：F：5’-GCTGACAGGATGCAGAAGG-3’；R：5’-CTGGAAGGTGCTGAGGGAT-3’），扩增产物电泳分析基因转录情况。qRT - PCR 在 ABI 7500 实时荧光定量 PCR 仪进行，反应体系含 SYBR Green Master Mix、引物及 cDNA 模板，按 2⁻ΔΔCt 法计算抗菌肽 D 基因相对表达量，剖析不同株系表达差异。
生长发育观测：将转基因及野生型番茄幼苗移栽至温室营养钵，基质配比为草炭土∶蛭石∶珍珠岩 = 3∶1∶1，定期浇水、施肥，模拟自然生长环境；记录植株株高、茎粗、叶片数、叶面积等形态指标，自移栽起每周测量 1 次，持续 8 周；待植株开花结果，统计花期、坐果率、单果重等生殖参数，明确基因导入对生长发育全程影响。
抗病性检测：以灰霉病菌、青枯病菌为病原菌，采用离体叶片接种与盆栽植株灌根接种法。离体叶片接种时，摘取生长一致叶片，表面消毒后用无菌打孔器制成叶盘，叶盘背面接种 10 μL 浓度为 1×10⁶ spores/mL 灰霉病菌孢子悬液，保湿培养，25℃、12 小时光照下观察病斑扩展，48 小时后测量病斑直径；盆栽植株灌根接种青枯病菌，待植株长至 6 - 8 叶期，每株灌施 50 mL 浓度 1×10⁸ CFU/mL 菌液，接种后监测发病症状，按病情分级标准（0 级：无症状；1 级：1/4 叶片萎蔫；2 级：1/2 叶片萎蔫；3 级：3/4 叶片萎蔫；4 级：全株死亡）记录病情指数，评估抗菌肽 D 基因抗病效能。
抗逆性评估：模拟干旱、盐胁迫环境，干旱处理组停止浇水至土壤相对含水量降至 30%，维持 10 天；盐胁迫组用 200 mmol/L NaCl 溶液浇灌，每周 3 次，持续 2 周；观测植株萎蔫、黄化、坏死等表型，测定叶片相对含水量、脯氨酸含量、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性，从生理生化层面解析植株抗逆潜能变化。
经农杆菌介导转化与严格筛选流程，共获 120 株卡那霉素抗性植株；移栽至温室初期，部分植株生长较弱、叶片发黄，淘汰 20 株生长不良个体，余 100 株用于后续鉴定。
PCR 检测：PCR 扩增产物电泳显示，85 株呈现预期 300 bp 清晰条带，初步阳性率达 85%，表明抗菌肽 D 基因已整合至多数番茄植株基因组；但 PCR 有假阳性可能，需结合 Southern 杂交精准甄别。
Southern 杂交：对 PCR 阳性植株杂交分析，68 株显杂交信号，单拷贝整合植株 42 株、双拷贝 20 株、多拷贝 6 株；剔除多拷贝不稳定株系，锁定 42 株单拷贝整合植株，单拷贝利于基因稳定表达、表型精准预测，契合后续研究要求。
RT - PCR 与 qRT - PCR：RT - PCR 结果显示，单拷贝整合转基因植株均转录抗菌肽 D 基因，野生型无对应条带；qRT - PCR 定量表明，不同株系基因表达量差异显著，最高表达株系是低株系 5.2 倍，为后续抗病表型关联分析提供关键数据，暗示表达量或与抗病程度紧密挂钩。
生长发育：连续 8 周生长监测发现，多数转基因植株生长指标与野生型相近，仅少数株系株高略降（降幅 5% - 10%）、叶面积稍小；花期、坐果率、单果重无显著波动，说明抗菌肽 D 基因植入未对番茄核心生长发育进程酿成严重干扰，基因安全性获初步佐证。
抗病性：离体叶片接种灰霉病菌 48 小时后，野生型叶盘病斑直径达 15 - 20 mm，病斑蔓延迅速、菌丝密布；转基因植株病斑直径多控制在 5 - 10 mm，部分高表达株系仅 3 - 5 mm，病斑扩展减缓、菌丝生长受抑，抗菌效果斐然。盆栽灌根接种青枯病菌 14 天后，野生型病情指数飙升至 80%，近乎全株萎蔫死亡；转基因植株病情指数介于 20% - 40%，植株维持生长，根系受损较轻，彰显抗菌肽 D 基因在活体植株抗病、保产价值。
抗逆性：干旱胁迫下，野生型植株叶片严重萎蔫、卷曲，相对含水量降至 40%；转基因植株相对含水量维持 60% - 70%，脯氨酸积累量是野生型 2 - 3 倍，抗氧化酶活性显著提升，协同减轻膜脂过氧化损伤。盐胁迫时，野生型叶尖黄化、坏死，生长停滞；转基因植株仅叶缘轻微失绿，新叶仍能伸展，植株耐受性增强，拓展番茄种植地域、环境适应性。
本研究精心构筑从基因整合、转录到表型全方面鉴定体系，精准锁定稳定表达抗菌肽 D 基因的优质番茄转基因株系，成果丰硕且具深度拓展性。在转化方法上，农杆菌介导转化效率达 70.8%（85/120），与同类研究相当，但部分植株生长异常凸显优化必要；后续拟调控侵染参数、外植体预处理提升效率、减少不良影响。
分子鉴定环节，PCR 初筛结合 Southern 杂交、RT - PCR 及 qRT - PCR，精确解析基因整合、表达全景；单拷贝整合优势凸显，为基因功能研究 ，但基因沉默、位置效应仍存，可借基因编辑、染色质免疫沉淀剖析深层机制。表型鉴定证实抗菌肽 D 基因强化番茄抗病、抗逆性，未干扰生长发育主线；不过田间复杂环境下长期稳定性、生态效应待考，后续将设多年多点田间试验，联合微生物群落分析评估生态安全。
本研究成功将抗菌肽 D 基因植入番茄，经系列严谨鉴定获 42 株稳定转基因株系；分子层面明晰基因整合、表达模式，表型上证实植株抗病、抗逆跃升且生长正常。研究成果为番茄抗病分子育种呈现实操范例，夯实抗菌肽基因工程应用基础；后续借多组学联合、田间验证，有望助推番茄产业绿色升级，生物防治革新潮流，拓展至更多作物病害防控，前景广阔。
