电穿孔转染外源基因于兔成体成纤维细胞

一、引言

二、材料与方法

（一）兔成体成纤维细胞的分离与培养

1. 组织采集：选取健康成年兔，在无菌条件下取其耳部皮肤组织，迅速将组织置于含高浓度抗生素（如青霉素 500 U/mL、链霉素 500 μg/mL）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，以防止细菌和真菌污染，维持组织活性。

2. 细胞分离：将皮肤组织用 PBS 反复清洗后，剪成约 1 - 2 mm³ 的微小组织块。使用含有 0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% 乙二胺四乙酸（EDTA）的消化液，在 37°C 水浴锅中振荡消化 30 - 60 分钟，使成纤维细胞从组织块中解离出来。

3. 细胞培养：消化结束后，加入含 10% 胎牛血清的 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培养基终止消化反应，将细胞悬液通过 200 目滤网过滤，去除未消化的组织块，收集滤液中的细胞。以适当的细胞密度（如 5×10⁴/cm²）接种于培养皿中，置于 37°C、5% CO₂培养箱中培养，每 2 - 3 天更换一次培养基，待细胞生长至 80% - 90% 融合时进行传代培养。

（二）外源基因与电穿孔试剂准备

1. 外源基因获取：根据研究目的，选择特定的外源基因（如绿色荧光蛋白基因 GFP 或具有特定功能的目的基因），通过基因克隆技术从含有该基因的模板（如质粒文库或基因合成片段）中扩增出目的基因片段，利用聚合酶链式反应（PCR）进行精确扩增，并对扩增产物进行纯化与鉴定，确保基因序列的准确性。

2. 电穿孔试剂选择：选用商业化的电穿孔专用缓冲液，如 Opti - MEM I Reduced Serum Medium 等，该缓冲液具有低离子强度、适宜的渗透压等特性，能够在电穿孔过程中减少对细胞的损伤并提高转染效率。同时，准备无菌的电击杯，确保其洁净度与良好的导电性，以保证电穿孔过程的顺利进行。

（三）电穿孔转染实验操作

1. 细胞准备：选取处于对数生长期、状态良好且融合度在 60% - 70% 的兔成体成纤维细胞，用预冷的电穿孔缓冲液轻轻洗涤细胞 2 - 3 次，去除培养基中的血清成分，因为血清中的蛋白质可能会干扰电穿孔过程中的电场作用与基因转染。

2. 基因 - 细胞混合：将纯化后的外源基因与适量的电穿孔缓冲液混合，调整基因浓度至合适范围（如 1 - 10 μg/mL），然后将细胞悬液缓慢加入到基因溶液中，轻轻混匀，使细胞与外源基因充分接触，避免产生气泡，以防影响电穿孔效果。

3. 电穿孔参数设置：将细胞 - 基因混合液转移至预冷的电击杯中，设置电穿孔仪的参数。主要参数包括电压（如 100 - 300 V）、脉冲宽度（如 10 - 50 ms）、脉冲次数（如 1 - 3 次）等。通过设计多组不同参数组合的实验，以确定在兔成体成纤维细胞中实现最佳转染效率的电穿孔参数。在设置参数时，需综合考虑细胞的耐受性与基因导入效率之间的平衡。

4. 电穿孔处理：在确认电击杯与电穿孔仪连接正确且参数设置无误后，启动电穿孔程序，施加脉冲电场。电穿孔过程瞬间完成，之后迅速将电击杯中的细胞悬液转移至含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，轻轻混匀，接种于培养皿或培养瓶中，放回 37°C、5% CO₂培养箱中培养，让细胞在适宜环境中恢复并表达外源基因。

（四）转染效率检测

1. 荧光显微镜观察：若转染的外源基因是带有荧光标记的基因（如 GFP），在转染后 24 - 48 小时，使用荧光显微镜观察细胞的荧光表达情况。在观察时，选取多个不同视野进行拍照记录，通过图像分析软件统计发出荧光的细胞数量占总细胞数量的比例，以此作为转染效率的初步直观评估指标。

2. 流式细胞术分析：收集转染后 48 小时的细胞，用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，然后用适量的 PBS 重悬细胞，调整细胞浓度至合适范围（如 1×10⁶/mL）。将细胞悬液加入流式细胞仪中，通过检测荧光强度来区分转染细胞与未转染细胞，精确计算转染效率。同时，还可利用流式细胞术分析转染细胞的其他生物学特性，如细胞周期分布、细胞凋亡情况等，以全面了解电穿孔转染对外源基因导入后细胞状态的影响。

3. 定量 PCR 检测：提取转染后细胞的总 RNA，使用逆转录试剂盒将 RNA 逆转录为 cDNA。然后利用特异性引物对转染的外源基因进行定量 PCR 扩增，同时以兔内参基因（如 β - 肌动蛋白基因）作为参照，通过比较外源基因与内参基因的扩增曲线与 Ct 值，计算出外源基因在细胞中的相对表达量，从基因转录水平准确评估转染效率与基因表达水平。

（五）转染后细胞的生物学特性分析

1. 细胞增殖能力检测：采用细胞计数法和 CCK - 8 试剂盒检测转染后兔成体成纤维细胞的增殖能力。在转染后的不同时间点（如 24 小时、48 小时、72 小时等），对细胞进行计数，绘制细胞生长曲线。同时，将细胞接种于 96 孔板中，每孔加入适量的 CCK - 8 溶液，在 37°C 培养箱中孵育 2 - 4 小时后，使用酶标仪测定 450 nm 处的吸光度值，根据吸光度值变化评估细胞增殖情况，分析电穿孔转染及外源基因表达对细胞增殖的影响。

2. 细胞迁移能力检测：利用划痕实验和 Transwell 小室迁移实验检测转染后细胞的迁移能力。在划痕实验中，将转染后的细胞接种于培养皿中，待细胞生长至融合状态后，用无菌枪头在细胞层上划一道划痕，然后用 PBS 清洗去除划下的细胞碎片，加入无血清培养基继续培养，在不同时间点（如 0 小时、12 小时、24 小时等）观察划痕愈合情况并拍照记录，通过测量划痕宽度的变化计算细胞迁移速度。在 Transwell 小室迁移实验中，将转染后的细胞接种于 Transwell 小室的上室，下室加入含 10% 胎牛血清的培养基作为趋化因子，培养 24 - 48 小时后，取出小室，用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，对下室迁移的细胞进行固定、染色并计数，评估细胞的迁移能力变化。

3. 细胞凋亡检测：采用 Annexin V - FITC/PI 双染法检测转染后细胞的凋亡情况。收集转染后不同时间点的细胞，用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，然后按照 Annexin V - FITC/PI 凋亡检测试剂盒的说明书操作，将细胞与 Annexin V - FITC 和 PI 染料在避光条件下孵育 15 - 30 分钟，最后用流式细胞仪检测细胞凋亡率，分析电穿孔转染及外源基因表达是否诱导细胞凋亡，以评估转染过程对细胞生存状态的影响。

三、结果

（一）兔成体成纤维细胞的培养特性

1. 细胞形态：分离培养的兔成体成纤维细胞在显微镜下呈现典型的成纤维细胞形态，细胞呈长梭形，有多个细长的突起，细胞核呈椭圆形，位于细胞中央。细胞在培养过程中贴壁生长，逐渐形成放射状或漩涡状的细胞群落，细胞之间连接紧密，生长状态良好。

2. 生长曲线：通过连续多日的细胞计数绘制生长曲线，结果显示兔成体成纤维细胞在接种后的前 24 小时处于潜伏期，细胞数量略有增加；随后进入对数生长期，细胞增殖速度加快，在培养 3 - 5 天后达到生长高峰；之后进入平台期，细胞数量趋于稳定，增殖速度减缓。

（二）电穿孔转染效率

1. 荧光显微镜观察结果：在转染后 24 小时，部分细胞开始出现微弱的荧光信号，随着时间推移到 48 小时，荧光强度逐渐增强且荧光细胞数量明显增多。经统计分析不同电穿孔参数下的荧光细胞比例，发现当电压为 200 V、脉冲宽度为 30 ms、脉冲次数为 2 次时，转染效率高，可达到 [X]%（具体数值依实验而定）。

2. 流式细胞术分析结果：流式细胞术检测结果与荧光显微镜观察结果基本一致，在优化后的电穿孔参数条件下，转染细胞的荧光阳性率较高，同时还发现转染过程对细胞周期分布有一定影响，部分细胞出现 G₂/M 期阻滞现象，但细胞凋亡率并未显著增加，表明在该条件下细胞能够较好地耐受电穿孔转染操作。

3. 定量 PCR 检测结果：定量 PCR 结果显示，转染后外源基因的相对表达量在转染后 48 小时达到较高水平，且与转染效率呈正相关。通过与内参基因的对比分析，进一步证实了在优化参数下外源基因在兔成体成纤维细胞中的有效转录与表达。

（三）转染后细胞的生物学特性分析结果

1. 细胞增殖能力：细胞计数法和 CCK - 8 实验结果表明，转染后细胞在短期内（如 24 - 48 小时）增殖速度略有下降，但随着时间推移逐渐恢复并接近未转染细胞的增殖水平。这可能是由于电穿孔转染过程对细胞造成了一定的损伤，在细胞修复后能够继续正常增殖，而外源基因的表达对细胞增殖未产生明显的长期抑制或促进作用。

2. 细胞迁移能力：划痕实验和 Transwell 小室迁移实验结果显示，转染特定外源基因后，兔成体成纤维细胞的迁移能力发生了改变。部分外源基因的导入促进了细胞的迁移，表现为划痕愈合速度加快和 Transwell 下室迁移细胞数量增多；而另一些外源基因则抑制了细胞迁移，具体变化与转染的外源基因功能密切相关，表明外源基因的表达能够调控兔成体成纤维细胞的迁移行为。

3. 细胞凋亡：Annexin V - FITC/PI 双染法检测结果显示，在转染后的早期（如 24 小时内），有少量细胞发生凋亡，凋亡率约为 [Y]%（具体数值依实验而定），这可能是电穿孔过程中电场对细胞造成的应激损伤所致。但随着时间推移，细胞凋亡率逐渐稳定并维持在较低水平，说明在优化的转染条件下，细胞能够有效应对转染带来的应激并维持正常的生存状态。

四、讨论