咨询热线

15614103871

当前位置:首页  >  技术文章  >  运用高效化学转化重组法构建重组腺病毒的研究

运用高效化学转化重组法构建重组腺病毒的研究

更新时间:2025-01-17      点击次数:101

摘要

本文采用高效化学转化重组法成功构建了重组腺病毒,详细描述了实验材料、方法以及结果。通过对构建体系的优化,提高了阳性重组率,为抗肿瘤生物治疗制剂的制备奠定了坚实基础。该法具有成本低、效率高、操作简便等优势,具有广阔的应用前景。

引言

重组腺病毒作为基因治疗的重要载体,因其宿主细胞范围广、转移效率高、滴度高及表达水平高等特点,广泛应用于肿瘤基因治疗、基因功能研究及疫苗开发等领域。然而,传统的重组腺病毒构建方法步骤繁琐、成本高且阳性重组率低,限制了其广泛应用。因此,优化重组腺病毒的构建方法,提高构建效率及阳性重组率,对于推进基因治疗研究具有重要意义。本研究采用高效化学转化重组法,旨在简化构建流程,提高构建效率,为制备具有更高抗肿瘤疗效的生物治疗制剂奠定基础。

材料与方法

1. 材料
2. 方法
2.1 构建重组腺病毒转移质粒
  1. PCR扩增目的基因:以携带目的基因的质粒为模板,通过PCR扩增获得目的基因全长序列。在5'端和3'端PCR引物中分别引入特定的酶切位点。

  2. 酶切与连接:将PCR产物及穿梭质粒分别进行双酶切,回收目的基因片段及穿梭质粒载体片段,用T4 DNA连接酶进行连接,构建重组穿梭质粒。

  3. 转化与鉴定:将连接产物转化大肠杆菌DH5α,通过PCR及酶切鉴定筛选出阳性克隆,并进行测序验证。

2.2 同源重组构建重组腺病毒质粒
  1. 线性化穿梭质粒:用PmeⅠ酶切重组穿梭质粒,回收线性化穿梭质粒。

  2. 化学转化法同源重组:将线性化穿梭质粒与腺病毒骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,筛选出阳性克隆。

  3. 鉴定与纯化:通过PacⅠ酶切鉴定同源重组成功的质粒,并用大抽质粒试剂盒进行大量质粒抽提。

2.3 包装与扩增重组腺病毒
  1. 线性化重组腺病毒质粒:用PacⅠ酶切重组腺病毒质粒,回收线性化质粒。

  2. 脂质体介导转染293细胞:将线性化质粒用脂质体LipofectamineTM2000介导转染至293细胞,进行包装。

  3. 观察与收集病毒:观察细胞病变效应(CPE),收集病变细胞,通过反复冻融、离心等方法制备病毒上清。

2.4 病毒纯化与滴度测定
  1. 病毒纯化:采用碘克沙醇密度梯度离心或层析法纯化病毒。

  2. 滴度测定:通过实时荧光定量PCR法测定病毒滴度。

实验结果

1. 重组腺病毒转移质粒的构建

成功构建了携带目的基因的重组腺病毒转移质粒,通过PCR及酶切鉴定,证实目的基因已成功插入穿梭质粒中。

2. 同源重组构建重组腺病毒质粒

采用化学转化法,成功实现了穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的同源重组,通过PacⅠ酶切鉴定,筛选出阳性克隆,获得了重组腺病毒质粒。

3. 包装与扩增重组腺病毒

将重组腺病毒质粒转染293细胞,观察到明显的CPE,收集病变细胞制备病毒上清。通过反复冻融、离心等方法,成功获得了重组腺病毒颗粒。

4. 病毒纯化与滴度测定

采用碘克沙醇密度梯度离心或层析法纯化病毒,获得了高纯度的重组腺病毒。通过实时荧光定量PCR法测定病毒滴度,结果显示病毒滴度达到较高水平。

讨论

1. 高效化学转化重组法的优势

本研究采用高效化学转化重组法构建重组腺病毒,相比传统方法,具有以下优势:

2. 实验策略的创新性
3. 应用前景

重组腺病毒作为基因治疗的重要载体,具有广阔的应用前景。本研究构建的高效化学转化重组法,为制备具有更高抗肿瘤疗效的生物治疗制剂奠定了坚实基础。该方法可广泛应用于肿瘤基因治疗、基因功能研究及疫苗开发等领域,具有重要的理论意义及实用价值。

结论

本研究采用高效化学转化重组法成功构建了重组腺病毒,通过优化构建流程,提高了阳性重组率及构建效率。该方法具有成本低、效率高、操作简便等优势,为抗肿瘤生物治疗制剂的制备提供了有力支持。未来,将进一步探索该方法的优化及应用,为基因治疗研究做出更大贡献。