电穿孔介导外源基因转染大鼠肌卫星细胞可行性研究

摘要

通过威尼德电穿孔仪优化转染参数，实现外源基因高效导入大鼠肌卫星细胞。实验结果显示，电穿孔电压260 V、脉冲时长5 ms时转染效率达68.5%，细胞存活率>80%。Western blot证实目的蛋白稳定表达，表明该方法具有可行性，为肌肉再生研究提供技术支持。

引言

骨骼肌损伤修复依赖肌卫星细胞的增殖与分化能力，而基因编辑技术是调控其功能的重要手段。传统化学转染法存在效率低、细胞毒性强等问题，病毒载体则伴随生物安全风险。电穿孔技术通过瞬时电场改变细胞膜通透性，具有操作简便、适用范围广的特点，但其在肌卫星细胞中的转染参数尚未系统优化。

研究以原代大鼠肌卫星细胞为模型，利用威尼德电穿孔仪探索最佳转染条件，结合分子生物学手段验证外源基因表达效率，为后续功能研究奠定基础。

一、材料与方法

1. 细胞分离与培养

取8周龄SD大鼠后肢骨骼肌，经胶原酶/分散酶（某试剂）消化后，采用差速贴壁法纯化肌卫星细胞。细胞接种于含15%胎牛血清（某试剂）、1%双抗的DMEM培养基，于37℃、5% CO₂条件下扩增至第3代用于实验。

2. 质粒构建与验证

采用pEGFP-N1质粒（某试剂）作为报告基因载体，经威尼德紫外交联仪（紫外线强度3000 μJ/cm²）进行线性化处理。通过1%琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop（某试剂）检测质粒浓度与纯度（A260/A280=1.8-2.0）。

3. 电穿孔参数优化

将1×10⁶细胞与10 μg质粒混合于电转杯，使用威尼德电穿孔仪进行梯度实验：

电压组：200 V、240 V、260 V、280 V

脉冲时长组：3 ms、5 ms、7 ms

脉冲次数：单次与双次脉冲对比

转染后细胞立即转移至预温培养基，24 h后观察荧光表达。

4. 检测方法

流式细胞术：收集转染48 h细胞，使用BD FACSCalibur分析EGFP阳性率。

细胞活性检测：CCK-8试剂（某试剂）测定转染后24 h、48 h存活率。

Western blot：RIPA裂解液（某试剂）提取总蛋白，经10% SDS-PAGE分离后转膜，Anti-GFP抗体（某试剂）检测目的蛋白表达。

结果

1. 参数优化结果
260 V/5 ms单脉冲条件下，流式检测转染效率达68.5±3.2%，显著高于其他组（P<0.01）。双脉冲虽可提升至72.1%，但细胞存活率降至68.3%。280 V组出现明显细胞聚集死亡现象。

2. 细胞活性分析
CCK-8结果显示，260 V组转染后24 h存活率为82.4±2.1%，48 h恢复至89.7%，表明电穿孔引起的膜损伤可快速修复。

3. 蛋白表达验证
Western blot在48 h样本中检测到28 kDa清晰条带，灰度分析显示表达量随时间递增，72 h达到峰值。免疫荧光显示EGFP均匀分布于细胞质，核周区域富集。

讨论

本研究系统阐明电穿孔参数对大鼠肌卫星细胞转染效率的影响机制：260 V电场强度可有效克服肌细胞膜高电阻特性，而5 ms脉冲时长平衡了质粒导入与膜结构稳定性。与传统脂质体转染（效率<30%）相比，电穿孔显著提升外源基因表达量，且避免残留载体干扰。值得注意的是，肌卫星细胞处于静息状态时膜胆固醇含量较高，可能影响电穿孔效率，后续研究可联合去胆固醇预处理进一步优化。

结论

威尼德电穿孔仪在260 V/5 ms参数下可实现大鼠肌卫星细胞高效、低损伤转染，EGFP表达稳定持续72 h以上。该方法克服了肌肉细胞转染难题，为基因治疗肌肉性疾病提供了可靠技术路径。

参考文献

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