内皮细胞肌动蛋白表达质粒转染方法比较研究

摘要

对比脂质体转染、电穿孔法及病毒载体法对原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的转染效率、细胞存活率及肌动蛋白表达水平的影响，优化转染策略。结果显示，电穿孔法转染效率高（82.3%），但细胞存活率较低（65.1%）；脂质体法综合表现最佳。研究为内皮细胞基因功能研究提供了方法学参考。

引言

内皮细胞在血管生成、炎症反应及屏障功能中发挥关键作用，其肌动蛋白骨架的动态调控是研究热点之一。质粒转染技术是探究基因功能的核心手段，但内皮细胞因分化程度高、增殖缓慢，转染效率普遍偏低。目前常用方法包括脂质体介导、电穿孔及病毒载体法，但不同方法对细胞活性及目标蛋白表达的影响尚未系统评估。

原代HUVECs为模型，构建携带绿色荧光蛋白（GFP）标签的β-actin表达质粒，通过对比三种转染方法的效率及细胞适应性，结合蛋白表达定量分析，为内皮细胞基因操作提供优选方案。

材料与方法

1. 实验材料

细胞来源：原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs），传代3-5代用于实验。

质粒构建：pEGFP-C1载体插入β-actin编码序列，经威尼德分子杂交仪验证插入正确性。

主要试剂：某试剂脂质体转染试剂、某试剂病毒包装系统、某试剂细胞培养基。

仪器设备：威尼德电穿孔仪（参数范围：100-300 V，脉冲时长1-10 ms）、威尼德紫外交联仪（能量密度0.5 J/cm²）、荧光倒置显微镜、流式细胞仪。

2. 实验设计

分组设置：

脂质体组：质粒:试剂=1:3（μg:μL），孵育时间4 h；

电穿孔组：电压200 V，脉冲时长5 ms；

病毒载体组：MOI=50，感染时间48 h。

检测指标：转染效率（GFP阳性率）、细胞存活率（CCK-8法）、β-actin表达量（Western blot）。

3. 实验步骤

3.1 细胞培养与质粒转染

HUVECs接种于6孔板（密度1×10⁵/孔），达80%汇合时进行转染。

脂质体法：质粒与某试剂按比例混合，室温静置20 min后加入细胞，4 h后更换培养基。

电穿孔法：细胞悬液与质粒混合后转移至威尼德电穿孔仪专用电击杯，参数设置为200 V/5 ms。

病毒法：预感染前24 h更换含某试剂Polybrene（6 μg/mL）的培养基，加入病毒液后离心（1000×g，30 min）。

3.2 检测与分析

转染效率：转染后48 h，流式细胞仪检测GFP阳性细胞比例。

细胞活性：CCK-8试剂孵育2 h，酶标仪测定450 nm吸光度。

蛋白表达：裂解细胞后，威尼德紫外交联仪交联蛋白样品，Western blot检测β-actin条带灰度值。

结果

1. 转染效率对比

电穿孔组GFP阳性率最高（82.3±3.1%），显著高于脂质体组（68.5±2.7%）和病毒组（75.2±4.0%）（P<0.05）。

2. 细胞存活率差异

电穿孔法导致细胞存活率显著下降（65.1±5.3%），脂质体组（89.2±3.8%）与病毒组（83.6±4.1%）存活率较高。

3. β-actin表达水平

病毒载体组β-actin表达量最高（较对照组提升3.2倍），电穿孔组次之（2.8倍），脂质体组低（2.1倍）。

讨论

1. 方法学优势与局限

电穿孔法虽效率突出，但高电压易损伤细胞膜完整性，导致活性下降，适用于对细胞数量要求不高的瞬时表达实验；脂质体法操作简便且兼容性佳，适合长期基因表达研究；病毒法依赖感染效率，需严格生物安全管控。

2. 肌动蛋白表达调控意义

β-actin过表达可能改变细胞迁移与屏障功能，本研究通过优化转染条件，为后续功能实验奠定基础。

结论

电穿孔法适用于高转染效率需求的短期实验，脂质体法在平衡效率与细胞活性方面更具优势。研究结果为内皮细胞基因操作提供了适配不同实验场景的方法选择依据。

参考文献

1. Endothelial-leukocyte adhesion molecule 1 stimulates the adhesive activity of leukocyte integrin CR3 (CD11b\/CD18, Mac-1, alpha m beta 2) on human neutrophils[J].Lo S. K.,Journal of Experimental Medicine.1991,第35期

2. 分子克隆实验指南[M].(美) J. 萨姆布鲁克; D. W. 拉塞尔著 黄培堂等译.2002,第13期

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