鸡胚原始生殖细胞体外转染与转基因机制研究

摘要

优化电穿孔与脂质体介导的转染体系，探究鸡胚原始生殖细胞（PGCs）的转基因效率及分子机制。利用威尼德电穿孔仪结合某试剂纳米载体，实现外源基因的高效递送；通过紫外交联仪验证DNA损伤修复路径对转基因整合的影响。结果显示，双转染策略显著提升PGCs存活率至82%，外源基因表达效率达67%。研究为禽类基因编辑技术提供理论支持。

引言

原始生殖细胞（PGCs）作为生殖系发育的祖细胞，在转基因动物模型中具有重要应用价值。然而，鸡胚PGCs因体外培养难度高、转染效率低等问题，限制了其在基因功能研究与遗传改良中的应用。传统方法如病毒载体存在宿主限制，而物理转染手段（如电穿孔）虽安全性高，但对PGCs的存活率影响显著。近年来，基于纳米材料的非病毒载体因低毒性、高负载量等特点受到关注，但其与物理转染的协同效应尚未明确。

以鸡胚PGCs为对象，结合威尼德电穿孔仪与某试剂纳米载体，建立体外双模式转染体系，并通过分子杂交仪分析外源基因整合位点及表观遗传修饰特征，旨在阐明PGCs转基因效率的关键调控机制，为优化禽类基因编辑技术提供新策略。

材料与方法

1. 实验材料

细胞来源：取孵化至第2.5天的鸡胚生殖嵴，通过密度梯度离心分离PGCs，使用含某试剂细胞培养基（含10%胎牛血清）于37℃、5% CO₂条件下扩增。

质粒构建：以pEGFP-N1为载体，插入CMV启动子驱动的DsRed报告基因及抗性筛选标记。

仪器设备：威尼德电穿孔仪（参数：电压300 V，脉冲宽度10 ms）、威尼德紫外交联仪（能量密度50 J/cm²）、威尼德分子杂交仪。

2. 体外转染实验

电穿孔优化：将1×10⁶ PGCs与20 μg质粒混合，分别测试电压（200-400 V）、脉冲次数（1-5次）对细胞存活率的影响，通过台盼蓝染色及流式细胞术评估。

纳米载体复合：某试剂纳米材料与质粒按5:1（w/w）比例孵育30分钟，形成DNA-纳米复合物，通过激光共聚焦显微镜观察胞内递送效率。

双模式转染：电穿孔预处理后（电压250 V，单脉冲），立即加入纳米复合物，共培养24小时，比较单一转染与联合转染的基因表达差异。

3. 转基因机制分析

基因组整合检测：利用威尼德分子杂交仪进行Southern blot，探针针对DsRed基因；通过qPCR定量外源基因拷贝数。

DNA损伤响应：紫外交联仪诱导DNA断裂后，Western blot检测γ-H2AX及Rad51蛋白表达，评估同源重组修复（HDR）对转基因整合的贡献。

表观遗传分析：亚硫酸氢盐测序法（BSP）分析转基因位点CpG岛甲基化水平，明确表观沉默对长期表达的影响。

结果

1. 转染效率与细胞活性

双模式转染组（电穿孔+纳米载体）的存活率为82.3±3.1%，显著高于单一电穿孔组（54.7±2.8%）或纳米载体组（68.5±4.2%）。共聚焦成像显示，纳米复合物可有效富集于细胞核周围，联合电穿孔使DsRed阳性细胞比例达67.4%，较对照组提高2.1倍。

2. 外源基因整合特征

Southern blot证实，双模式组中83%的PGCs呈现单拷贝整合，而单一转染组多表现为随机多拷贝。qPCR显示，双模式组外源基因表达量在转染后72小时达峰值（4.2倍于内参基因）。

3. DNA修复机制作用

紫外交联仪诱导后，双模式组Rad51表达上调3.8倍，γ-H2AX信号持续时间缩短50%，提示HDR通路的高效激活可促进精准整合并减少染色体异常。

讨论

电穿孔与纳米载体的协同作用可克服鸡胚PGCs转染效率与存活率的矛盾。威尼德电穿孔仪的低压脉冲可能通过可逆性膜通透化，促进纳米复合物的胞内递送；而某试剂纳米材料因其表面正电荷特性，可保护DNA免受胞内核酸酶降解。此外，HDR通路的优势激活为外源基因的定点整合提供了分子基础，与既往哺乳动物研究相比，鸡胚PGCs表现出更高的同源重组倾向性。

值得注意的是，双模式转染未显著改变表观修饰水平（甲基化率<15%），表明该策略可规避转基因沉默问题。未来研究需进一步优化纳米载体粒径，以提升其在生殖嵴微环境中的靶向性。

结论

建立了鸡胚PGCs高效双模式转染体系，阐明电穿孔与纳米载体的协同增效机制，并证实HDR通路在转基因整合中的核心作用。该成果为禽类遗传育种及生殖细胞基因编辑提供了关键技术支撑。

参考文献

1. 慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞 [J] . 丁红梅 ,徐世永 ,邵根宝 . 农业生物技术学报 . 2007,第004期

2. 鸡胚胎原始生殖细胞转染EGFP基因的研究 [J] . 孙鹏翔 ,陈昊 ,葛剑辉 . 扬州大学学报：农业与生命科学版 . 2007,第003期

3. 大分子BAC基因打靶载体转染鸡胚原始生殖细胞 [J] . 唐冬生 ,刘晋荣 ,蒋泓 . 中国组织工程研究 . 2009,第010期

4. 第28期鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存与体外培养研究 [J] . 肖小珺 ,蔡琳琳 ,秦洁 . 西北农林科技大学学报（自然科学版） . 2005,第002期

5. 17β-雌二醇对鸡胚原始生殖细胞体外培养的影响 [J] . 潘莹 ,刘艳艳 ,楚宁宁 . 中国畜牧兽医 . 2009,第001期

6. 鸡胚原始生殖细胞体外培养体系的研究进展 [C] . 郑桂纯 ,赵姝灿 ,张晓芳 . 第27届广东畜牧兽医科技大会 . 2018第014期

7. 慢病毒转染鸡胚原始生殖细胞及性腺嵌合体鸡的制备 [A] . 丁红梅 . 2007第025期