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ERCC1密码子118单核苷酸多态性细胞转染模型构建与功能分析

更新时间:2025-03-10      点击次数:59

摘要

ERCC1基因密码子118单核苷酸多态性(C118T)的细胞转染模型,并探讨其功能影响。通过定点突变技术构建野生型与突变型ERCC1表达载体,利用威尼德电穿孔仪转染至HEK293T细胞,验证转染效率及SNP位点。功能分析表明,突变型ERCC1显著降低DNA损伤修复能力并增强顺铂敏感性。结果为ERCC1基因多态性与化疗耐药性关联研究提供模型支持。

引言

ERCC1(Excision Repair Cross-Complementation Group 1)是核苷酸切除修复(NER)通路的核心基因,其表达水平与铂类化疗药物耐药性密切相关。密码子118(C118T)单核苷酸多态性(SNP)导致氨基酸由丙氨酸替换为苏氨酸,可能影响ERCC1蛋白功能及稳定性。然而,现有研究多基于临床样本关联分析,缺乏直接的功能验证模型。


ERCC1-C118T SNP的体外细胞模型,结合基因编辑与功能分析,明确该多态性对DNA修复能力及药物敏感性的影响,为个体化化疗方案设计提供实验依据。

实验部分

1. 质粒构建与定点突变

采用PCR扩增技术从人基因组DNA中获取ERCC1基因全长序列,克隆至pcDNA3.1载体。针对密码子118(C>T)设计特异性引物,通过重叠延伸PCR引入突变。反应体系含某试剂高保真DNA聚合酶,扩增条件:98℃预变性2分钟,30个循环(98℃ 10秒,60℃ 15秒,72℃ 2分钟),72℃延伸5分钟。突变质粒经威尼德分子杂交仪验证后,送测序确认SNP位点。

2. 细胞培养与转染

HEK293T细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃、5% CO₂条件下传代。取对数生长期细胞,接种于6孔板(密度1×10⁶/孔),24小时后分别转染野生型(ERCC1-WT)与突变型(ERCC1-C118T)质粒。转染使用某试剂脂质体法,同时设置空载体对照组。转染后48小时,通过威尼德紫外交联仪检测荧光报告基因表达效率,筛选稳定转染细胞株。

3. SNP位点功能验证

提取转染细胞总RNA,反转录为cDNA,采用qRT-PCR定量ERCC1 mRNA表达水平。蛋白水平通过Western blot检测,一抗为某试剂ERCC1单克隆抗体(1:1000),二抗为HRP标记羊抗鼠IgG(1:5000)。使用威尼德原位杂交仪进行免疫荧光染色,观察ERCC1蛋白亚细胞定位。

4. 功能分析

1)细胞增殖与凋亡实验CCK-8法检测顺铂(0-20 μM)处理48小时后细胞存活率;Annexin V-FITC/PI双染法流式检测凋亡率。

2)DNA损伤修复能力评估UV-C照射(20 J/m²)诱导DNA损伤,彗星实验(单细胞凝胶电泳)定量DNA碎片化程度;γ-H2AX免疫荧光染色分析双链断裂修复效率。

结果与讨论

1. 模型构建成功性验证
测序结果显示,突变型质粒C118T位点匹配设计。Western blot证实转染细胞中ERCC1蛋白表达量显著高于对照组(P<0.01),且突变型蛋白分子量无显著差异。

2. SNP对DNA修复功能的影响
彗星实验显示,突变型ERCC1细胞在UV照射后尾矩较野生型增加35%(P<0.05),表明DNA修复能力下降。γ-H2AX焦点数量在突变型细胞中持续升高至24小时,而野生型在12小时即显著减少。

3. 顺铂敏感性差异
突变型细胞经10 μM顺铂处理后,存活率较野生型降低42%(P<0.01),凋亡率增加2.3倍(P<0.001)。提示C118T多态性可能通过削弱NER功能增强化疗药物毒性。

结论

ERCC1-C118T SNP细胞模型,证实该位点突变导致DNA损伤修复能力下降及顺铂敏感性升高。此模型为ERCC1多态性机制研究及临床化疗疗效预测提供了可靠工具。

参考文献

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