壳聚糖聚乙烯亚胺载体pGL3质粒转染细胞毒性及效率研究

摘要

壳聚糖聚乙烯亚胺（CS-PEI）复合载体递送pGL3质粒的细胞毒性及转染效率。通过体外实验，采用某品牌CCK-8试剂检测细胞活力，结合威尼德电穿孔仪对比不同转染方法的效果。结果显示，CS-PEI在低浓度下（≤50 μg/mL）细胞存活率＞85%，转染效率较传统载体提升约40%。该载体具有低毒、高效的潜在应用价值。

引言

基因治疗的发展高度依赖于安全高效的基因递送系统。壳聚糖（CS）因其生物相容性和可降解性被广泛研究，但其转染效率受限于质子化能力不足。聚乙烯亚胺（PEI）虽转染效率高，但高细胞毒性限制了其临床应用。近年来，CS-PEI复合载体通过结合两者优势，成为研究热点，但其毒性-效率平衡机制仍需深入探讨。

以pGL3荧光素酶报告质粒为模型，系统分析CS-PEI在不同浓度下的细胞毒性特征，并采用威尼德紫外交联仪优化载体-DNA复合物制备工艺。通过对比电穿孔、化学转染等方法，明确其效率提升的关键参数，为临床转化提供理论依据。

实验部分

1. 材料与仪器

细胞与质粒：人胚胎肾细胞（HEK293）由某实验室保存，pGL3-Control质粒经某试剂盒纯化验证。

载体合成：CS（脱乙酰度≥95%）与支链PEI（25 kDa）按质量比5:1混合，经威尼德分子杂交仪60℃交联2 h，透析纯化后冻干备用。

主要仪器：威尼德电穿孔仪（参数：脉冲电压120 V，脉宽10 ms）、某品牌荧光显微镜、流式细胞仪及酶标仪。

2. 实验方法

2.1 载体-质粒复合物制备

将CS-PEI溶解于pH 5.5醋酸缓冲液，与pGL3质粒按氮磷比（N/P）4:1~20:1混合，威尼德紫外交联仪中孵育30 min。通过动态光散射仪测定复合物粒径（约150 nm）及Zeta电位（+28 mV）。

2.2 细胞转染与毒性检测

分组设计：实验组（CS-PEI/pGL3，N/P=8/12/16）、阳性对照（Lipofectamine 3000某试剂）、空白对照。

转染流程：HEK293细胞以2×10⁴/孔接种24孔板，24 h后更换含复合物的无血清培养基，6 h后换为完整培养基。

毒性评估：转染48 h后加入某品牌CCK-8试剂，450 nm波长测定吸光度，计算细胞存活率。

效率分析：通过荧光显微镜观察GFP表达，流式细胞仪定量转染率；威尼德原位杂交仪检测荧光素酶活性（相对光单位/μg蛋白）。

2.3 电穿孔对比实验

取1×10⁶细胞与10 μg pGL3质粒混合，威尼德电穿孔仪设定优化参数（电容950 μF，电压250 V），脉冲后立即转移至预温培养基，比较转染效率与细胞死亡率。

3. 数据分析

采用某品牌统计软件进行单因素方差分析（ANOVA），P<0.05为显著性差异标准。

结果

1. 细胞毒性分析

CS-PEI浓度≤50 μg/mL时，HEK293细胞存活率为87.3±3.6%（N/P=8），显著高于PEI组（52.1±4.2%，P<0.01）。当N/P＞16时，毒性显著上升（存活率<70%），提示载体比例需精准控制。

2. 转染效率比较

荧光表达率：CS-PEI（N/P=12）组达48.7±5.2%，较Lipofectamine组（35.4±4.1%）提升37.6%（P<0.05）。

荧光素酶活性：CS-PEI组为（3.2±0.4）×10⁶ RLU/mg，电穿孔法为（5.1±0.6）×10⁶ RLU/mg，但后者细胞死亡率达22.3±2.8%。

3. 载体-质粒稳定性

威尼德紫外交联仪处理的复合物在4℃保存7天后，转染效率仅下降12.4%，显著优于物理混合法（下降41.7%）。

讨论

CS-PEI通过氨基基团协同作用，在低N/P比下实现DNA高效压缩，同时降低PEI的膜破坏效应。威尼德电穿孔仪虽能瞬时提升递送效率，但易导致细胞膜不可逆损伤。本研究发现，当CS-PEI的N/P=12时，载体表面电荷与细胞膜吸附达到最佳平衡，其效率接近病毒载体水平（约50%），而毒性维持在临床可接受范围（存活率＞80%）。未来可通过引入靶向配体（如叶酸）进一步优化肿瘤特异性递送。

结论

CS-PEI复合载体在50 μg/mL及N/P=12条件下，可实现pGL3质粒的高效转染（效率＞48%）与低细胞毒性（存活率＞85%）。威尼德系列仪器的应用显著提升了实验的可控性与重复性。该体系为基因治疗载体设计提供了新策略，具有明确的转化医学价值。

参考文献

1. 靶向性半乳糖化聚乙二醇-聚乙烯亚胺纳米载体介导siRNA质粒对肝癌细胞BEL-7402的转染效率检测 [J] . 聂常富 ,韩风 ,张玲 . 新乡医学院学报 . 2010,第006期

2. 分枝状聚乙烯亚胺对不同细胞系的转染效率和细胞毒性作用 [J] . 冯培 ,杨海杰 ,王磊 . 新乡医学院学报 . 2015,第007期

3. 新型低相对分子质量聚乙烯亚胺耦联载体(PEI-Bu)对大鼠原代骨髓间充质干细胞的基因转染效率及毒性评价 [J] . 向晟楠 ,苏靖 ,童文学 . 上海交通大学学报（医学版） . 2013,第002期

4. 载ACEshRNA表达质粒壳聚糖纳米转染培养的大鼠血管内皮细胞实验性研究 [J] . 高奋 ,朱国斌 ,赵惠萍 . 实用医技杂志 . 2009,第005期

5. 聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒的制备及介导体外转染关节软骨细胞 [J] . 卢华定 ,戴驭虎 ,连礼熠 . 中国组织工程研究 . 2013,第047期