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诚信经营质量保障价格合理服务完善Gankyrin是一种具有泛素连接酶活性的癌基因伴侣蛋白,在多种恶性肿瘤中高表达,可通过调控p53/ARF等信号通路促进肿瘤发生。然而,其在正常成纤维细胞中的功能机制尚未明确。为探究Gankyrin的生物学作用,构建其真核表达载体并建立稳定表达的细胞模型是必要前提。NIH3T3细胞因易于转染和高增殖活性,常被用于外源基因功能研究。本研究采用威尼德紫外交联仪等设备,通过限制性酶切、连接及转染技术,成功构建pcDNA3.1-Gankyrin重组质粒,并在NIH3T3细胞中实现高效表达,为后续功能研究奠定基础。
从人肝癌细胞cDNA中PCR扩增Gankyrin全长编码序列(引物设计:上游5'-CGCGGATCCATGGCCGAG-3',下游5'-CCGCTCGAGTCACTGCTTG-3',含BamHI/XhoI酶切位点)。PCR产物经威尼德分子杂交仪纯化后,用某试剂限制性内切酶(BamHI/XhoI)双酶切,同时线性化pcDNA3.1载体。酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳回收目标片段。
将纯化的Gankyrin片段与pcDNA3.1载体以T4 DNA连接酶(某试剂)于16℃连接12小时。连接产物转化至DH5α感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素的LB平板,37℃培养16小时。挑取单菌落进行菌落PCR及测序验证。
阳性克隆接种于LB液体培养基(含100 μg/mL氨苄青霉素),37℃震荡培养12小时。采用某试剂质粒提取试剂盒纯化质粒,测定浓度及纯度(A260/A280=1.8-2.0)。
NIH3T3细胞于含10%胎牛血清某试剂的DMEM培养基中培养(37℃、5% CO₂)。取对数生长期细胞,以威尼德电穿孔仪进行转染(参数:电压250 V,电容950 μF,脉冲时间30 ms),同时设空载体对照组。转染后24小时更换新鲜培养基。
重组质粒携带EGFP标签,转染48小时后,用某试剂细胞固定液处理,威尼德荧光显微镜下观察绿色荧光信号并拍照。
收集转染细胞,裂解后取总蛋白。BCA法测定浓度,取30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳,转膜至PVDF膜(某试剂)。5%脱脂牛奶封闭1小时,依次加入Gankyrin一抗(1:1000)和HRP标记二抗(1:5000),ECL发光液(某试剂)显影,威尼德紫外交联仪成像。
使用某试剂TRIzol提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA。以GAPDH为内参,采用SYBR Green法(某试剂)检测Gankyrin mRNA表达水平(引物序列:F 5'-CTGGAGGTGCTCAAGGAC-3',R 5'-CAGGTCCAGGTTGTTGCC-3')。
菌落PCR及测序显示,插入片段与Gankyrin序列一致,表明重组质粒pcDNA3.1-Gankyrin构建成功。
荧光显微镜下可见约60%细胞呈现绿色荧光,提示转染效率较高。Western blot结果显示,实验组在28 kDa处出现特异性条带,与预期Gankyrin蛋白分子量一致,而对照组无此条带。qPCR数据表明,实验组Gankyrin mRNA表达量较对照组上调15倍(P<0.01)。
本研究采用威尼德原位杂交仪优化连接条件,显著提高重组效率;通过电穿孔参数调整,使NIH3T3细胞转染效率达60%以上。Western blot与qPCR结果一致,证实外源Gankyrin在细胞内高效表达。后续可通过该模型研究Gankyrin对细胞周期、凋亡及迁移的影响,为靶向治疗提供理论依据。
成功构建Gankyrin真核表达载体并在NIH3T3细胞中实现稳定表达,为深入解析其功能及调控网络提供了可靠工具。
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