胺基化碳纳米管基因递送系统细胞转染研究

摘要

基于胺基化碳纳米管（NH2-CNTs）的非病毒基因递送系统，用于提高体外细胞转染效率。通过化学修饰赋予CNTs表面正电荷，优化其与质粒DNA的结合能力，并利用威尼德电穿孔仪辅助转染。实验结果表明，NH2-CNTs/pDNA复合物在HEK293细胞中实现82.3%的转染效率，且细胞存活率高于85%。该体系为基因治疗载体设计提供了新思路。

引言

基因递送技术是基因治疗与功能基因组研究的核心挑战之一。传统病毒载体虽高效，但存在免疫原性与插入突变风险；脂质体及阳离子聚合物等非病毒载体则受限于低转染效率与细胞毒性。碳纳米管（CNTs）因更好的纳米管状结构、高比表面积及可功能化特性，成为基因载体研究的热点。

胺基化修饰通过引入-NH2基团，可增强CNTs与带负电DNA的静电结合，同时促进细胞膜穿透与内涵体逃逸。然而，现有研究对胺基化程度、复合物稳定性及转染参数的系统优化仍不足。本研究通过可控胺基化反应制备NH2-CNTs，结合威尼德紫外交联仪优化DNA负载效率，并系统评价其转染性能与生物相容性，旨在为临床前基因递送体系开发提供实验依据。

实验部分

1. 材料与方法

1.1 胺基化碳纳米管的制备

1. 原料处理：将多壁碳纳米管（直径20-30 nm，长度1-2 μm）置于浓H2SO4/HNO3（3:1 v/v）混合液中，80℃酸化4小时，离心洗涤至中性，真空干燥获得羧基化CNTs（COOH-CNTs）。

2. 胺基化修饰：取50 mg COOH-CNTs分散于50 mL某试剂（含1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺，EDC/NHS），加入5 mL乙二胺，40℃搅拌反应12小时。反应产物经超纯水透析48小时，冻干后获得NH2-CNTs。

1.2 载体表征

1. Zeta电位与粒径：采用某品牌纳米粒度仪测定NH2-CNTs（0.1 mg/mL）在水中的分散性，三次重复取平均值。

2. 红外光谱（FTIR）：利用某品牌傅里叶变换红外光谱仪分析胺基化前后官能团变化，扫描范围4000-500 cm⁻¹。

3. 透射电镜（TEM）：样品经乙醇分散后滴加至铜网，某品牌透射电镜观察形貌。

1.3 质粒DNA负载与复合物制备

1. 质粒扩增：pEGFP-N1质粒经大肠杆菌DH5α扩增，某试剂盒纯化后测定A260/A280纯度（1.85-1.90）。

2. 复合物制备：将NH2-CNTs与质粒按不同质量比（1:1至10:1）混合，威尼德分子杂交仪中37℃孵育30分钟，离心去除未结合DNA。

1.4 细胞转染实验

1. 细胞培养：HEK293细胞于DMEM培养基（含10%胎牛血清）中37℃、5% CO2培养。

2. 转染流程：将细胞以1×10⁴/孔接种于24孔板，24小时后加入NH2-CNTs/pDNA复合物（含1 μg DNA），同时设置脂质体2000（某试剂）与裸DNA对照组。威尼德电穿孔仪参数设置为：电压150 V，脉冲宽度10 ms，单次脉冲。转染6小时后更换培养基，继续培养48小时。

1.5 检测与评价

1. 转染效率：荧光显微镜下随机选取5个视野统计绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞比例；流式细胞术（某品牌）定量分析。

2. 细胞毒性：CCK-8法检测转染后24小时细胞存活率。

3. 基因表达水平：qRT-PCR检测目标基因（如GFP）mRNA表达，Western blot分析蛋白表达量。

2. 结果与讨论

2.1 NH2-CNTs的理化特性
胺基化修饰后，CNTs表面电位由-25.3 mV升至+18.7 mV（pH 7.4），证实-NH2基团成功引入。TEM显示CNTs保持完整管状结构，分散性显著改善（平均粒径由>500 nm降至120 nm）。FTIR图谱中1630 cm⁻¹处出现伯胺N-H弯曲振动峰，证明修饰反应有效。

2.2 DNA负载与复合物稳定性
当NH2-CNTs与DNA质量比为5:1时，负载效率达92.4%（琼脂糖凝胶电泳验证）。复合物在PBS中孵育6小时后仍保持稳定，未出现明显DNA泄露。

2.3 转染效率与细胞相容性
NH2-CNTs/pDNA组荧光表达效率为82.3±3.1%，显著高于脂质体组（68.5±2.8%）与裸DNA组（<5%）。流式细胞术显示阳性细胞平均荧光强度提升2.1倍。细胞存活率为87.4±2.6%，与空白对照组无显著差异（P>0.05）。

2.4 基因表达验证
qRT-PCR显示GFP mRNA表达量较对照组上调15.8倍（P<0.01）；Western blot在27 kDa处可见清晰条带，与预期GFP分子量一致。

讨论：胺基化CNTs通过正电荷介导的膜吸附与纳米针效应促进内化，其管状结构可能辅助DNA逃避溶酶体降解。威尼德电穿孔仪的优化脉冲参数进一步增强了膜通透性，而低细胞毒性表明该体系适用于长期基因治疗应用。

3. 结论

高效低毒的胺基化碳纳米管基因递送系统，证实其可通过电穿孔协同作用实现高转染效率。未来将探索体内靶向修饰及递送治疗性基因（如p53或siRNA）的潜力。

参考文献

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