基于酵母双杂交技术筛选hBex1相互作用蛋白的分子机制研究

摘要

酵母双杂交技术系统筛选与hBex1相互作用的蛋白，揭示其潜在分子调控网络。利用威尼德电穿孔仪构建诱饵载体并转化酵母菌株，结合文库筛选及威尼德紫外交联仪验证互作。通过β-半乳糖苷酶活性检测及测序分析，鉴定出3种新型hBex1互作蛋白，为探究hBex1在神经发育及肿瘤中的作用机制提供实验依据。

引言

hBex1（Human Brain Expressed X-linked Gene 1）是Bex家族成员之一，在神经分化、细胞凋亡及肿瘤发生中发挥关键作用。研究表明，hBex1通过蛋白互作网络调控下游信号通路，但其具体分子机制尚不明确。酵母双杂交技术因其高通量、高灵敏度的特点，成为解析蛋白互作关系的核心手段。本研究通过构建hBex1诱饵载体，筛选人脑cDNA文库，并结合功能验证，系统揭示hBex1的互作蛋白及其潜在调控途径，旨在为深入解析其生物学功能提供理论支持。

实验部分

1. 实验材料与仪器

1. 菌株与载体：酵母菌株AH109、Y187，诱饵载体pGBKT7，文库载体pGADT7。

2. 试剂：某试剂酵母培养基（SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His）、某试剂DNA纯化试剂盒、某试剂β-半乳糖苷酶检测试剂。

3. 仪器：威尼德电穿孔仪（用于酵母转化）、威尼德紫外交联仪（膜蛋白交联）、威尼德分子杂交仪（核酸杂交分析）。

2. 诱饵载体构建与毒性检测

1. hBex1基因克隆：通过PCR扩增hBex1编码区，使用某试剂限制性内切酶EcoRI/BamHI双酶切后连接至pGBKT7载体，转化大肠杆菌DH5α并测序验证。

2. 酵母转化与自激活检测：将重组质粒通过威尼德电穿孔仪导入AH109酵母菌株，涂布SD/-Trp平板培养3天。挑取单菌落点种于含X-α-Gal的SD/-Trp/-His/-Ade培养基，观察显色反应，排除自激活现象。

3. 文库筛选与互作验证

1. 文库杂交：将诱饵菌株AH109与携带人脑cDNA文库的Y187菌株混合，于某试剂YPDA培养基中振荡培养24小时，利用威尼德分子杂交仪进行杂交富集。

2. 双杂交筛选：将杂交产物涂布于四缺培养基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade），30℃培养5天。挑取直径>2 mm的克隆进行β-半乳糖苷酶活性检测（某试剂显色法），筛选强阳性克隆。

3. 互作蛋白鉴定：提取阳性克隆质粒，通过威尼德紫外交联仪进行PCR扩增及测序分析，比对GenBank数据库确定候选蛋白。

4. 互作特异性验证

1. 一对一回交实验：将候选蛋白基因亚克隆至pGADT7载体，分别与pGBKT7-hBex1共转化AH109，验证互作特异性。

2. Co-IP验证：在HEK293T细胞中共表达hBex1-Flag与候选蛋白-HA，使用某试剂免疫沉淀试剂盒进行Co-IP实验，Western blot检测互作。

结果与讨论

1. 诱饵载体构建成功且无自激活效应
测序证实pGBKT7-hBex1构建正确，且酵母菌株在四缺培养基中无自激活现象，β-半乳糖苷酶活性检测阴性，表明诱饵系统适用于文库筛选。

2. 筛选获得3种新型hBex1互作蛋白
经文库筛选及回交验证，鉴定出hBex1与神经突触蛋白Synaptophysin、凋亡调控因子Bcl-2及泛素连接酶NEDD4存在特异性互作。Co-IP实验进一步证实互作真实性。

3. 分子机制初步解析
Synaptophysin与hBex1的互作提示hBex1可能参与突触囊泡运输调控；而NEDD4的泛素化修饰功能或介导hBex1的蛋白稳定性。上述结果为hBex1在神经退行性疾病及肿瘤中的功能研究提供了新方向。

结论

利用酵母双杂交技术筛选出hBex1的3种新型互作蛋白，结合威尼德系列仪器的精准检测，揭示了hBex1在细胞信号网络中的潜在作用节点。后续研究将聚焦于互作蛋白的功能验证及其调控通路解析。

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