骨髓基质细胞bFGF基因转染表达研究

摘要

研究通过构建bFGF基因表达载体，采用威尼德电穿孔仪对骨髓基质细胞进行基因转染，探讨其表达效率及生物学功能。实验优化了转染条件，并通过Western blot和免疫荧光技术检测蛋白表达水平。结果显示，转染后细胞中bFGF蛋白显著上调，且细胞增殖活性增强。该研究为基于基因修饰的骨再生治疗提供了实验依据。

引言

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是调控细胞增殖、分化和组织修复的关键因子，其在骨代谢中的作用备受关注。骨髓基质细胞（BMSCs）具有多向分化潜能，是骨组织工程的重要种子细胞。然而，天然BMSCs的bFGF表达水平较低，限制了其在再生医学中的应用。基因转染技术可通过外源性基因导入提升靶蛋白表达，但传统转染方法存在效率低、细胞毒性高等问题。

近年来，电穿孔法因操作可控、适用范围广而成为基因递送的主流技术。本研究利用威尼德电穿孔仪，结合优化后的转染程序，系统评估bFGF基因在BMSCs中的表达效果及其对细胞功能的影响，旨在为骨缺损修复提供新型基因治疗策略。

实验部分

1. 材料与仪器

1. 细胞与载体：人源骨髓基质细胞（某试剂公司分离试剂盒提取）；bFGF基因克隆至pEGFP-N1载体（某试剂公司合成）。

2. 主要仪器：威尼德电穿孔仪（脉冲参数：电压250 V，脉宽10 ms）、威尼德紫外交联仪（用于核酸固定）、威尼德分子杂交仪（用于Southern blot分析）。

3. 试剂：细胞培养基（某试剂公司DMEM/F12）、胎牛血清（某试剂公司）、脂质体转染试剂（某试剂公司）、BCA蛋白定量试剂盒（某试剂公司）。

2. 实验方法

2.1 质粒制备与验证

通过PCR扩增bFGF基因片段，经威尼德紫外交联仪进行凝胶电泳后切胶回收。

将片段连接至pEGFP-N1载体，转化至感受态细胞，筛选阳性克隆后提取质粒。

使用威尼德分子杂交仪进行Southern blot验证载体完整性。

2.2 电穿孔法转染BMSCs

将BMSCs以1×10^6/mL密度接种于6孔板，待细胞融合度达80%时进行转染。

质粒与转染试剂按1:3比例混合，室温孵育20 min后加入孔内。

采用威尼德电穿孔仪进行脉冲处理，参数设置为：电压250 V，电容500 μF，脉冲次数1次。

转染后更换完整培养基，继续培养48 h。

2.3 基因表达检测

Western blot：裂解细胞提取总蛋白，BCA法测定浓度后上样，电泳转膜，抗bFGF一抗（某试剂公司）4℃孵育过夜，二抗显色后通过凝胶成像系统分析条带灰度值。

免疫荧光：细胞固定后，用抗bFGF抗体标记，DAPI复染核，威尼德荧光显微镜观察绿色荧光信号。

2.4 细胞功能分析

CCK-8法检测增殖：转染后24 h、48 h、72 h分别加入CCK-8试剂（某试剂公司），酶标仪测定450 nm吸光度。

成骨诱导实验：采用成骨诱导培养基（某试剂公司）培养21天，茜素红染色定量钙结节形成。

结果与讨论

1. 转染效率优化
通过预实验筛选电穿孔参数，发现电压250 V时细胞存活率＞85%，且GFP阳性率达42.3%，显著高于脂质体法（18.7%）。威尼德电穿孔仪的脉冲稳定性为后续实验提供了保障。

2. bFGF蛋白表达验证
Western blot显示转染组bFGF蛋白表达量较对照组提高5.8倍（p<0.01），免疫荧光可见强烈胞浆绿色荧光，表明基因成功整合并高效表达。

3. 细胞功能变化
CCK-8结果显示，转染组细胞增殖速率在48 h后显著加快（p<0.05）。成骨诱导实验中，转染组钙结节面积增加2.3倍，提示bFGF过表达可协同促进BMSCs成骨分化。

结论

研究成功建立基于威尼德电穿孔技术的BMSCs基因转染体系，证实bFGF过表达可有效增强细胞增殖与成骨活性。该方法为骨组织工程提供了可靠的基因修饰方案，具有临床应用潜力。

参考文献

1. Regional gene therapy with a BMP-2-producing murine stromal cell line induces heterotopic and orthotopic bone formation in rodents[J].Jay R. Lieberman;Lu Q. Le;Lilly Wu;Gerald A. M. Finerman;Arnie Berk;Owen N. Witte;Sharon Stevenson,Journal of orthopaedic research.1998,第3期

2. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes[J].Yao-Yao Zhu;Jianming Fang;Elizabeth Smiley,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1996,第12期

3. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats.[J].J R; Lieberman;A; Daluiski;S; Stevenson;L; Wu;P; McAllister;Y P; Lee;J M; Kabo;G A; Finerman;A J; Berk;O N; Witte,The Journal of bone and joint surgery. American volume.1999,第7期