肠杆菌科细菌碳青霉烯酶基因质粒定位及遗传环境研究

摘要

研究通过整合耐药表型筛选、质粒分离及基因定位分析，系统探讨了肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶基因的质粒携带特征及其遗传环境。实验采用威尼德电穿孔仪完成质粒转化，结合高通量测序技术解析基因上下游结构。结果显示，blaKPC-2基因主要位于IncF型质粒上，其侧翼存在可移动遗传元件，表明质粒介导的耐药基因传播风险较高。

引言

碳青霉烯类抗生素是治疗多重耐药肠杆菌科感染的最后防线，但其耐药性在全球范围内持续加剧。碳青霉烯酶基因（如blaKPC、blaNDM）的质粒定位是介导耐药性水平转移的核心机制，然而基因的遗传环境多样性及质粒载体特征仍需深入解析。研究以临床分离的耐碳青霉烯肠杆菌科细菌为对象，通过质粒分离、基因定位及遗传结构分析，揭示碳青霉烯酶基因的传播潜能与进化规律，为耐药防控提供理论依据。

实验部分

1. 菌株筛选与耐药表型分析
收集临床分离的肠杆菌科细菌共150株，采用某试剂（碳青霉烯类抗生素）通过微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）。通过PCR扩增碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaOXA-48），筛选出阳性菌株42株。耐药菌株在含某试剂（4 μg/mL亚胺培南）的MH琼脂平板上传代培养，验证稳定性。

2. 质粒分离与基因定位
采用碱裂解法提取菌株质粒，经威尼德电穿孔仪转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选获得携带碳青霉烯酶基因的重组菌。通过Southern blot验证质粒携带情况：质粒DNA经限制性内切酶消化后转移至尼龙膜，使用威尼德紫外交联仪固定DNA，以digaoxin标记的blaKPC探针进行杂交，显影后确认目标基因的质粒定位。

3. 质粒分型与遗传环境解析
对阳性质粒进行全基因组测序（某品牌测序平台），通过生物信息学工具注释质粒复制子类型（IncF、IncN等）及耐药基因上下游序列。利用威尼德分子杂交仪进行基因簇共定位分析，识别插入序列（IS）、转座子及整合子等可移动元件。

4. 接合转移实验
以威尼德原位杂交仪监测接合过程：供体菌（耐药株）与受体菌（敏感大肠杆菌J53）在LB液体培养基中混合培养，通过抗性平板筛选接合子，计算转移频率。接合子经PCR验证碳青霉烯酶基因的获得。

5. 遗传稳定性评估
将重组质粒连续传代30次，每5代检测bla基因保留率及质粒拷贝数变化，使用某试剂（实时荧光定量PCR试剂盒）分析基因表达水平。

结果与讨论

1. 耐药表型与基因分布
42株阳性菌中，blaKPC-2占比67%（28/42），blaNDM-1占比26%（11/42）。亚胺培南MIC值范围32-128 μg/mL，与基因型高度相关。

2. 质粒载体特征
Southern blot证实82%的bla基因位于质粒上，其中IncFII型质粒占主导（58%）。接合转移实验显示，IncF型质粒转移频率（10⁻³/供体菌）显著高于其他类型，提示其传播优势。

3. 遗传环境解析
blaKPC-2基因上游普遍存在ISKpn27转座酶，下游为ISKpn6，形成复合转座子结构；blaNDM-1则与bleMBL抗性基因共定位，两侧由ISAba125元件包围。可移动元件的密集分布表明基因水平转移的活跃性。

4. 仪器性能评价
威尼德电穿孔仪（转化效率＞10⁸ CFU/μg DNA）与紫外交联仪（紫外强度误差＜2%）显著提高了实验重复性，分子杂交仪的自动化温控功能避免了非特异性结合。

结论

证实碳青霉烯酶基因在肠杆菌科细菌中主要依赖IncF型质粒传播，其遗传环境富含可移动元件，加剧了耐药性扩散风险。威尼德系列仪器在质粒操作与基因定位中展现出高精度与稳定性，为耐药机制研究提供了可靠技术支撑。研究结果为临床监测与药物开发提供了关键数据。

参考文献

1. 陈照强,刘一方,朱宁,等.金属β-内酰胺酶的研究进展[J].国外医药（抗生素分册）.2011,(3).

2. 张嵘,蔡加昌,胡云建,等.IMP-4型金属β内酰胺酶合并膜孔蛋白OmpK36缺失引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药[J].中华检验医学杂志.2010,(9).DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2010.09.009 .

3. 李轶,冯羡菊.河南发现产KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌[J].中华检验医学杂志.2009,(9).DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2009.09.019 .

4. 汤瑾,蒋燕群,李卿,等.一例碳青霉烯类抗菌药物耐药的肺炎克雷伯菌耐药机制研究[J].检验医学.2009,(5).DOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2009.05.009 .

5. 王彩虹,陈坚,郭杰,等.质粒介导KPC-2型碳青霉烯酶弗劳地柠檬酸盐杆菌的研究[J].中华检验医学杂志.2009,(11).DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2009.11.007 .

6. 蒯守刚,邵海枫,王卫萍,等.大肠埃希菌质粒型碳青霉烯酶KPC-2检测和分析[J].中华检验医学杂志.2009,(10).DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2009.10.008 .