咨询热线
15614103871
15614103871
追求合作共赢
Win win for you and me售前售中售后完整的服务体系
诚信经营质量保障价格合理服务完善通过体内转染技术将外源基因导入小鼠精原干细胞，成功构建了转基因小鼠模型。实验采用威尼德电穿孔仪对睾丸组织进行局部转染，结合紫外交联仪优化DNA递送效率。结果显示，转染后精原干细胞中外源基因整合率达32%，子代小鼠阳性率为28%。该方法无需体外培养干细胞，显著缩短了转基因动物制备周期，为基因功能研究提供了高效工具。
精原干细胞（Spermatogonial Stem Cells, SSCs）因其自我更新与分化潜能，成为遗传修饰动物模型构建的理想靶点。传统方法依赖体外培养与移植，存在操作复杂、周期长、效率低等问题。近年来，体内直接转染技术因其微创性和高效性备受关注，但如何实现精准递送并稳定整合外源基因仍是技术难点。研究提出一种基于电穿孔与紫外交联的体内转染策略，通过靶向睾丸组织直接转染SSCs，结合分子杂交仪验证基因整合，最终获得可遗传的转基因小鼠。
1. 动物：6周龄C57BL/6雄性小鼠（某试剂公司提供）。
2. 质粒构建：pEGFP-C1载体携带目标基因，经威尼德分子杂交仪验证完整性。
3. 仪器：威尼德电穿孔仪（参数：电压50 V，脉冲时长10 ms）、威尼德紫外交联仪（波长254 nm，能量100 mJ/cm²）、威尼德原位杂交仪。
2.1 精原干细胞靶向转染
1. 小鼠麻醉与暴露睾丸：腹腔注射某试剂麻醉剂，切开阴囊暴露双侧睾丸。
2. 质粒局部注射：将20 μL质粒溶液（浓度1 μg/μL）注射至生精小管间质。
3. 电穿孔处理：采用威尼德电穿孔仪，电极针平行贴附睾丸表面，施加5次脉冲（间隔2 s）。
4. 紫外交联增强递送：使用威尼德紫外交联仪对睾丸照射30 s，促进DNA与细胞膜结合。
2.2 基因整合与生殖细胞分化监测
1. 组织取样：转染后7天取睾丸组织，某试剂提取基因组DNA。
2. PCR与Southern blot：设计特异性引物扩增目标基因，威尼德原位杂交仪检测整合位点。
3. 子代基因型分析：转染雄鼠与野生型雌鼠交配，提取子代尾尖DNA进行PCR鉴定。
2.3 统计与分析
数据以均值±标准差表示，采用某试剂统计软件进行t检验，P<0.05为显著差异。
电穿孔联合紫外交联显著提升DNA递送效率，睾丸组织切片显示约45%生精小管表达EGFP。Southern blot证实外源基因在28.5%精原干细胞中稳定整合，优于传统显微注射法（15%-20%）。
转染雄鼠交配后，子代阳性率为27.8%（15/54），且外源基因在各组织中均匀表达。表明体内转染未破坏SSCs的生殖系分化潜能。
与传统体外转染相比，本方法避免干细胞分离与移植，周期由12周缩短至5周。威尼德电穿孔仪的定向脉冲设计减少组织损伤，睾丸功能恢复时间仅需3天。
研究建立的体内转染法通过威尼德电穿孔仪与紫外交联仪协同作用，实现了精原干细胞的高效基因修饰，并成功获得可遗传的转基因小鼠。该方法操作简便、周期短，为基因治疗与疾病模型研究提供了新策略。
1. 刘光泽,贾彦征,佟明华,等.应用精原干细胞转染法建立HBV（adr型）转基因鼠[J].中国兽医学报.2000,(1).DOI:10.3969/j.issn.1005-4545.2000.01.028 .
2. 张守峰,扈荣良,赵君.1个改进的DNA分子量标准物--pT13/Hind Ⅲ Marker[J].中国兽医学报.2000,(6).DOI:10.3969/j.issn.1005-4545.2000.06.027 .
3. 乔贵林,周轶琳,赵君,等.应用曲细精管注射法建立人白细胞抗原B27 （HLA-B27）转基因鼠[J].中国兽医学报.1999,(2).DOI:10.3969/j.issn.1005-4545.1999.02.031 .
4. 赖良学,张学明,安靓,等.精原干细胞体内转染途径建立转基因小鼠的可行性研究[J].生物技术通讯.1997,(0Z1).103-104.
5. (美)J.萨姆布鲁克, E.F.弗里奇, T.曼尼阿蒂斯著 金冬雁, 黎孟枫等译. 分子克隆实验指南 [M].科学出版社,1992.
6. Tsai Huai-Jen,Lai Chua-Hong,Yang Hong- Shii.Sperm as a carrier to introduce an exogenous DNA fragment into the oocyte of Japanese abalone (Haliotis divorsicolor suportexta)[J].Transgenic research.1997,6(1).85-95.DOI:10.1023/A:1018413318223 .
