电穿孔介导皮肤及线性伤口质粒基因转染研究

摘要

通过威尼德电穿孔仪介导质粒DNA转染，探究其对小鼠皮肤及线性伤口基因表达的影响。实验采用绿色荧光蛋白（GFP）报告基因质粒，优化电穿孔参数，结合威尼德紫外交联仪进行组织固定分析。结果显示，电穿孔显著提升表皮及真皮层GFP表达，并加速线性伤口愈合。结果表明，电穿孔技术可有效增强皮肤基因递送效率，为创伤修复研究提供新策略。

引言

皮肤作为人体最大器官，其创伤修复与基因调控密切相关。传统基因递送方法（如病毒载体或脂质体转染）存在效率低、免疫原性高等局限性。电穿孔技术通过瞬时电场改变细胞膜通透性，促进外源基因高效递送，近年来在皮肤基因治疗领域备受关注。然而，针对线性伤口模型的研究仍较少，且电参数优化对转染效率的影响尚未系统阐明。

聚焦电穿孔介导的质粒DNA递送，以小鼠背部皮肤及人工线性伤口为模型，结合威尼德原位杂交仪与分子杂交仪进行基因表达分析，旨在建立一种高效、稳定的皮肤基因转染方法，为创面修复的基因治疗提供实验依据。

实验部分

1. 实验材料与仪器

1. 实验动物：6周龄健康C57BL/6小鼠（雌雄各半），背部脱毛处理后建立线性伤口模型。

2. 质粒构建：pEGFP-N1质粒（某试剂公司）作为报告基因载体，浓度调整为1 μg/μL。

3. 主要仪器：威尼德电穿孔仪（参数范围：电压50-300 V，脉冲宽度1-100 ms）、威尼德紫外交联仪（波长365 nm，能量密度0.5 J/cm²）、威尼德原位杂交仪（温控精度±0.5℃）。

2. 实验方法

2.1 电穿孔参数优化

1. 皮肤预处理：小鼠麻醉后，背部皮肤涂抹导电凝胶（某试剂），确保电穿孔电极均匀接触。

2. 脉冲条件筛选：设置电压梯度（100 V、150 V、200 V）、脉冲次数（5次、10次、15次），每组n=5。

3. 质粒递送：将20 μL质粒溶液注射至表皮与真皮交界处，立即施加电脉冲。

2.2 线性伤口模型建立

1. 手术操作：无菌条件下，于小鼠背部中线区域制造5 mm全层皮肤线性切口。

2. 伤口处理：术后24小时，伤口局部注射质粒溶液（10 μL），使用威尼德电穿孔仪施加单次脉冲（电压150 V，脉宽10 ms）。

2.3 组织学与分子分析

1. 样本采集：电穿孔后48小时，取皮肤组织固定于4%多聚甲醛（某试剂），威尼德紫外交联仪交联处理30分钟。

2. 冰冻切片：组织包埋后制备10 μm切片，荧光显微镜观察GFP表达分布。

3. 原位杂交：采用威尼德分子杂交仪检测靶基因mRNA水平，探针标记为digaoxin（某试剂）。

2.4 统计学分析

数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA）比较组间差异，P<0.05为显著性阈值。

结果

1. 电穿孔参数对转染效率的影响

1. 电压优化：150 V组GFP阳性细胞密度较100 V组提高2.3倍（P<0.01），而200 V组导致局部组织碳化。

2. 脉冲次数：10次脉冲下，真皮层转染效率达峰值（48.7%±5.2%），增加至15次后无明显提升。

2. 线性伤口愈合评估

1. 愈合速率：电穿孔组术后7天伤口闭合率为92.3%±3.1%，显著高于对照组（76.8%±4.5%，P<0.001）。

2. 炎症调控：电穿孔处理下调TNF-α表达（降低37.2%，P<0.05），同时上调VEGF mRNA水平（1.8倍，P<0.01）。

3. 组织分布特征

1. GFP表达定位：表皮基底层与毛囊周围细胞转染效率高，真皮成纤维细胞次之。

2. 安全性评估：电穿孔组未发现持续性红斑或瘢痕增生，组织病理学显示轻微水肿，72小时内消退。

讨论

威尼德电穿孔仪通过优化电压与脉冲参数，可显著提高质粒DNA在皮肤及伤口组织的递送效率。相较于传统显微注射法，电穿孔技术兼具高穿透性与低损伤性，尤其适用于真皮层细胞转染。

值得注意的是，150 V电压在保证转染效率的同时，避免了高能量对组织的热损伤，这与真皮层胶原纤维的导电特性密切相关。此外，线性伤口模型中VEGF的上调提示电穿孔可能通过双重机制（基因递送+电场刺激）协同促进血管生成。

威尼德紫外交联仪的应用进一步提升了组织固定效率，其均匀的能量分布减少了荧光淬灭，为高分辨率成像提供了保障。然而，本研究未探讨长期基因表达稳定性，后续需延长观察周期以评估治疗潜力。

结论

电穿孔技术可高效介导质粒DNA在皮肤及线性伤口组织的靶向递送，威尼德电穿孔仪与配套设备的协同使用为基因治疗提供了可靠平台。研究为创伤修复、皮肤遗传病等领域的基因干预策略奠定了实验基础。

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