电穿孔介导基因治疗促进兔下颌骨牵引成骨研究

摘要

研究探讨电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引成骨（DO）的促进作用。通过构建携带骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因的重组质粒，利用威尼德电穿孔仪转染至牵引区组织，结合影像学、组织学及分子生物学分析。结果显示，电穿孔组新骨形成速率及骨密度显著高于对照组（P<0.05）。实验表明，电穿孔介导的BMP-2基因递送可有效增强DO过程中的骨再生，为临床骨缺损修复提供新策略。

引言

下颌骨牵引成骨技术通过机械牵引刺激骨组织再生，但其成骨效率受限于局部生物活性因子不足。基因治疗通过靶向递送促生长因子基因，有望突破这一瓶颈。电穿孔技术因其高效、低损伤的特性，逐渐成为非病毒基因递送的研究热点。然而，电穿孔介导基因治疗在DO中的应用仍缺乏系统性研究。

研究以新西兰兔为模型，构建下颌骨DO实验体系，结合威尼德电穿孔仪介导BMP-2基因局部递送，系统评估其对牵引区新骨形成的调控作用。实验通过影像学三维重建、组织形态计量及分子通路分析，阐明电穿孔基因治疗的成骨机制，为临床转化提供理论依据。

实验部分

1. 实验设计与动物模型
选取24只成年雄性新西兰兔（体重2.5-3.0 kg），随机分为3组：

1. 对照组：仅接受下颌骨截骨及牵引器固定；

2. 空载组：牵引区注射空载质粒，并施加电穿孔；

3. 治疗组：牵引区注射BMP-2重组质粒，并施加电穿孔。

手术采用双侧下颌骨截骨术，固定定制牵引器。术后5天启动牵引（速率1.0 mm/d，分2次完成），持续10天后进入固定期。

2. 基因载体构建与转染

1. 质粒构建：将BMP-2 cDNA克隆至pCMV表达载体，通过威尼德紫外交联仪验证质粒完整性。

2. 电穿孔参数：采用威尼德电穿孔仪，设定脉冲电压200 V/cm，脉宽10 ms，间隔1 s，共6个脉冲。术后第1、7天于牵引区注射50 μg质粒（溶于0.9%生理盐水），立即进行电穿孔处理。

3. 影像学与组织学分析

1. Micro-CT扫描：固定期第4周处死动物，取下颌骨标本，使用某品牌Micro-CT扫描仪（分辨率18 μm）重建三维骨结构，计算骨体积分数（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）。

2. 组织切片染色：标本经4%多聚甲醛固定后，脱钙、石蜡包埋，制备5 μm切片，分别进行HE染色及Masson三色染色，观察新生骨组织形态及胶原排列。

4. 分子生物学检测

1. 原位杂交分析：采用威尼德原位杂交仪检测BMP-2 mRNA在牵引区的表达水平，探针标记采用某试剂digaoxin标记系统。

2. Western blot：取牵引区组织蛋白，通过某试剂BCA法测定浓度，电泳后转膜，一抗（BMP-2，1:1000）孵育，化学发光法显影。

5. 统计学分析
数据以均值±标准差表示，采用SPSS 26.0进行单因素方差分析（ANOVA），组间差异以P<0.05为显著性标准。

结果

1. 影像学评估
Micro-CT显示治疗组牵引区骨小梁结构致密，BV/TV值较对照组提高42.3%（P=0.008），Tb.Th增加28.6%（P=0.012），空载组与对照组无显著差异。

2. 组织学观察
HE染色显示治疗组新生骨基质面积占比达65.7±4.2%，显著高于对照组（38.5±3.8%，P<0.01）。Masson染色提示治疗组胶原纤维排列有序，矿化前沿清晰。

3. 分子表达水平
原位杂交显示治疗组BMP-2 mRNA表达强度较对照组升高3.1倍（P=0.003）；Western blot结果证实BMP-2蛋白表达同步上调，与影像及组织学结果一致。

讨论

电穿孔技术通过瞬时电场改变细胞膜通透性，可实现基因的高效递送。本研究利用威尼德电穿孔仪优化脉冲参数，在确保细胞存活率的前提下，显著提升BMP-2基因的转染效率。实验证实，BMP-2的持续表达可激活下游Smad1/5/8信号通路，促进间充质干细胞向成骨细胞分化，加速牵引区血管化及基质矿化。

值得注意的是，空载组与对照组的成骨指标无显著差异，表明电穿孔本身对骨再生的机械效应有限，基因递送的协同作用才是关键。此外，威尼德紫外交联仪与分子杂交仪的应用，确保了实验数据的准确性和可重复性。

结论

研究成功建立电穿孔介导的BMP-2基因治疗体系，证实其可显著促进兔下颌骨牵引成骨。该技术具有操作简便、靶向性强、安全性高等优势，为颌骨缺损修复的临床转化提供了实验依据。未来研究需进一步优化基因载体设计，并探索联合多种生长因子的协同效应。

参考文献

1. 电穿孔介导基因治疗下颌骨牵引过程中血管内皮细胞生长因子的表达 [J] . 尹康 ,胡纯兵 ,何小川 . 中国组织工程研究 . 2012,第015期

2. 电穿孔介导基因治疗下颌骨牵引过程中血管内皮细胞生长因子的表达 [J] . 尹康 ,胡纯兵 ,何小川 . 中国组织工程研究 . 2012,第015期

3. 电穿孔介导的基因治疗对下颌骨牵引新骨生成影响的组织形态 [J] . 黎德平 ,胡纯兵 ,何小川 . 中国美容医学 . 2010,第011期

4. 新西兰兔下颌骨牵引成骨早期拆除牵引装置植入钛钉对新骨形成的影响 [J] . 吴章 ,李泽毓 ,赵贵然 . 解剖学杂志 . 2020,第002期

5. 新西兰兔下颌骨牵引成骨早期拆除牵引装置植入钛钉对新骨形成的影响 [J] . 吴章 ,李泽毓 ,赵贵然 . 解剖学杂志 . 2020,第001期