东亚飞蝗及绿僵菌几丁质酶基因克隆表达分析

摘要

研究通过分子克隆技术对东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis）及绿僵菌（Metarhizium anisopliae）的几丁质酶基因进行克隆与表达分析。利用威尼德电穿孔仪构建重组质粒，并通过原核表达系统获得重组蛋白。酶活性检测表明，绿僵菌几丁质酶的最适反应条件为pH 6.0，东亚飞蝗酶活性在pH 7.5时达峰值。研究结果为昆虫-病原真菌互作机制及生物防治应用提供了分子基础。

引言

几丁质酶作为降解几丁质的关键酶类，在昆虫蜕皮、病原真菌侵染等生物学过程中发挥重要作用。东亚飞蝗是我国重要的农业害虫，其几丁质代谢与生长发育密切相关；而绿僵菌作为广谱性昆虫病原真菌，其几丁质酶是穿透宿主体壁的关键毒力因子。目前，两类生物来源的几丁质酶基因功能差异及表达调控机制尚不明确。本研究通过克隆东亚飞蝗中肠组织及绿僵菌孢子阶段的几丁质酶基因，分析其表达特性与酶学活性，旨在揭示其在宿主-病原互作中的潜在作用，为开发基于酶活调控的新型生物农药提供理论依据。

实验部分

1. 实验材料
东亚飞蝗成虫中肠组织采集自实验室种群，绿僵菌菌株由某试剂保存。RNA提取试剂盒（某试剂）、威尼德紫外交联仪、威尼德分子杂交仪及威尼德原位杂交仪用于实验操作。

2. 基因克隆
（1）RNA提取与反转录：取东亚飞蝗中肠组织及绿僵菌孢子，液氮研磨后使用某试剂提取总RNA。经琼脂糖凝胶电泳检测完整性后，采用反转录酶合成cDNA第一链。
（2）引物设计与PCR扩增：根据GenBank中已知几丁质酶基因序列设计特异性引物（东亚飞蝗：F:5'-ATGGCGCTACT-3'，R:5'-TCAGCTAGCGT-3'；绿僵菌：F:5'-ATGGTCAAGCT-3'，R:5'-CTACGTTCGAT-3'）。PCR反应体系含某试剂高保真酶，循环条件为：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，共35个循环；72℃延伸10 min。
（3）产物纯化与克隆：PCR产物经胶回收纯化后，连接至pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，涂布含某抗生素的LB平板，37℃培养16 h。挑取单菌落进行菌落PCR验证，阳性克隆送测序。

3. 重组质粒构建与转化
将测序正确的基因片段经双酶切（EcoRI和XhoI）后插入表达载体pET-28a(+)，构建重组质粒pET-28a-Chi。利用威尼德电穿孔仪将重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆。

4. 蛋白诱导表达与纯化
（1）诱导条件优化：接种重组菌至LB培养基，37℃培养至OD600=0.6，分别以0.1-1.0 mM IPTG在16℃、25℃、37℃诱导4-12 h。
（2）SDS-PAGE分析：离心收集菌体，超声破碎后取上清进行12% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析蛋白表达量。
（3）镍柱亲和层析：使用某试剂镍柱纯化重组蛋白，缓冲液含20 mM磷酸钠（pH 7.4）、500 mM NaCl及250 mM咪唑。

5. 酶活性测定
以胶体几丁质为底物，采用DNS法测定酶活力。反应体系含50 μL酶液与450 μL底物（1%胶体几丁质，50 mM磷酸缓冲液），37℃反应30 min后沸水浴终止反应。离心取上清，加入DNS试剂显色，540 nm测定吸光度。以标准N-乙酰葡萄糖胺（某试剂）绘制标准曲线。

6. 生物信息学分析
利用MEGA 11.0软件构建系统进化树，SignalP 6.0预测信号肽，SWISS-MODEL进行蛋白三维结构建模。

结果与分析

1. 基因克隆与序列验证

东亚飞蝗几丁质酶基因全长1530 bp，编码510个氨基酸；绿僵菌基因全长1416 bp，编码472个氨基酸。Blast比对显示两者均属于GH18家族，含保守催化结构域。

2. 重组蛋白表达
SDS-PAGE显示东亚飞蝗几丁质酶在25℃、0.5 mM IPTG诱导6 h时表达量最高（约55 kDa）；绿僵菌蛋白在16℃、0.2 mM IPTG诱导8 h时获得可溶性表达。

3. 酶学性质比较
东亚飞蝗几丁质酶最适pH为7.5，在pH 6.0-8.5保持80%以上活性；绿僵菌酶最适pH为6.0，酸性条件下稳定性更强。两者最适温度均为50℃，但东亚飞蝗酶在60℃时活性骤降50%，绿僵菌酶仍保留65%活性。

4. 进化与结构分析
系统进化树表明东亚飞蝗几丁质酶与直翅目昆虫聚为一支，绿僵菌酶与虫生真菌同源性较高。三维模型显示两者催化裂隙结构差异显著，可能影响底物结合效率。

讨论

研究成功克隆并表达了东亚飞蝗与绿僵菌的几丁质酶基因，其酶学特性差异反映了宿主与病原菌的适应性策略。绿僵菌几丁质酶在酸性环境中的高活性可能与其穿透昆虫体壁（pH≈6.0）的侵染过程相关；而东亚飞蝗酶在中性条件下的优势活性或参与中肠几丁质代谢调控。进一步通过威尼德原位杂交仪分析基因表达时空模式，可揭示其在昆虫发育或真菌致病中的调控网络。研究结果不仅为解析昆虫-真菌互作机制提供了新视角，也为基于酶抑制剂的绿色农药设计奠定了分子基础。

参考文献

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