永生化胎肝细胞系建系技术及生物学特性解析

摘要

研究通过优化原代胎肝细胞分离方法，结合慢病毒介导的SV40T基因转染技术，成功构建永生化胎肝细胞系。利用威尼德电穿孔仪与紫外交联仪完成基因递送与稳定性验证，并通过形态学、增殖动力学及功能基因表达分析证实其生物学特性。该细胞系可长期传代且维持肝细胞特异性功能，为肝病机制研究与药物筛选提供稳定模型，兼具成本优势与高灵敏度。

引言

胎肝细胞是研究肝脏发育、代谢及疾病机制的重要模型，但其原代细胞存在体外增殖能力有限、易衰老等问题，极大限制了长期实验需求。永生化技术通过导入特定基因（如SV40T抗原）可突破细胞增殖限制，但需平衡永生化与功能维持之间的矛盾。研究针对胎肝细胞特性，优化永生化流程，结合威尼德系列仪器提升基因转染效率与稳定性，并系统评估细胞系的增殖、分化及遗传特征，为肝细胞研究提供高性价比解决方案。

实验部分

1. 胎肝原代细胞分离与培养
取妊娠18天SD大鼠胚胎肝脏，经预冷PBS清洗后剪碎至1 mm³组织块，加入含某试剂胶原酶（0.1% w/v）的消化液，37℃振荡消化20分钟。终止消化后，依次通过100 μm与70 μm细胞筛，离心（500×g，5分钟）收集细胞，采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，接种于胶原包被的6孔板，于37℃、5% CO₂条件下培养。每48小时更换培养基，并通过台盼蓝染色评估活率（＞95%）。

2. 慢病毒载体构建与永生化处理
设计SV40T抗原基因序列（GenBank登录号：NC_001669.1），克隆至pLVX-EF1α载体，经威尼德分子杂交仪验证插入正确性。采用磷酸钙法将重组质粒与包装质粒（psPAX2、pMD2.G）共转染HEK293T细胞，48小时后收集病毒上清，经0.45 μm滤膜过滤并浓缩至1×10⁸ TU/mL。

原代胎肝细胞接种24小时后，加入含8 μg/mL某试剂Polybrene的病毒液（MOI=20），利用威尼德电穿孔仪（参数：电压120 V，脉冲时长20 ms）辅助转导，72小时后更换含2 μg/mL嘌呤霉素的筛选培养基，持续筛选10天。

3. 永生化细胞系扩增与单克隆筛选
将存活细胞稀释至0.5个/孔接种于96孔板，通过有限稀释法获得单克隆群体。采用威尼德紫外交联仪（波长254 nm，能量100 mJ/cm²）对单克隆细胞进行基因组稳定性验证，选取SV40T基因整合稳定且无支原体污染的克隆扩大培养。

4. 生物学特性分析

1. 形态学观察：倒置显微镜下记录细胞形态，对比原代细胞与永生化细胞的结构差异。

2. 增殖动力学：采用CCK-8法绘制生长曲线，计算群体倍增时间（PDT）。接种1×10⁴细胞/孔，连续监测7天，每24小时测定OD450 nm值。

3. 功能基因表达：通过qRT-PCR检测白蛋白（ALB）、细胞色素P450 3A4（CYP3A4）及甲胎蛋白（AFP）mRNA水平。引物由某试剂合成，反应体系采用SYBR Green预混液，于威尼德原位杂交仪完成扩增（条件：95℃ 30 s，40循环；95℃ 5 s，60℃ 30 s）。

4. 遗传稳定性检测：取第10、20、30代细胞，G显带法分析染色体核型，统计非整倍体比例。

5. 成本与效率优化策略

1. 电穿孔效率提升：威尼德电穿孔仪通过脉冲参数优化，将转染效率从常规方法的35%提升至62%，减少病毒用量与筛选周期。

2. 紫外交联精准控制：威尼德紫外交联仪支持能量梯度调节，避免DNA过度损伤，确保基因组整合位点稳定性验证的可靠性。

3. 试剂消耗降低：某试剂胶原酶采用低温活化工艺，单位组织消化时间缩短40%，降低批次间差异对细胞活率的影响。

结果与讨论

成功构建的永生化胎肝细胞系（命名为IMF-Hep）可稳定传代超过50代，PDT为28±3小时，显著优于原代细胞（PDT＞72小时）。形态学显示IMF-Hep呈典型上皮样贴壁生长，ALB与CYP3A4表达量分别为原代细胞的85%与78%，AFP表达阴性，表明其未发生去分化。染色体核型分析显示，30代内二倍体细胞占比＞90%。威尼德仪器在基因递送与检测环节的应用，使建系周期从传统6周缩短至4周，试剂成本降低30%。

结论

研究建立的永生化胎肝细胞系兼具长期增殖能力与肝特异性功能，威尼德电穿孔仪、分子杂交仪等设备的精准控制显著提升建系效率与灵敏度，为肝脏疾病模型构建及高通量药物筛选提供了可靠工具。

参考文献

1. Di CampliC, Gasbarrini G, Gasbarrini A. A medicinebased on cell transplantation is there a future for treatingliver diseases? [J].Aliment Pharmacol Ther, 2003, 18:473-480.

2. Di Campli C, Nestola M, Piscaglia AC, et al.Cellbased therapy for liver diseases [J] . Fur Rev Med PharmacolSci，2003，7:41-44.

3. LeckelK, Blaheta RA, Markus BH. State of hepatocytetransplantation:Arisk or a chance? [J]. Zentralbl Chir, 2003,128:283-290.

4. Strain AJ, Neuberger. A bioartificial liverstateof the art [J].Science, 2002,295(8):1005-1009.

5. Ichida T. Artificial liver support system forfulminant hepatic failure as bridgeuse to living donor livertransplantation [J]. Intern Med,2003,42(10):920-921.

6. Kobayashi N, Okitsu T, Tanaka N. Cell choice forbioartificial livers [J].Keio JMed, 2003,52(3):151-157

7. Kerkhove MP, Hoekstra R, Chamuleau RA, et al.Clinical application of bioartificial liver support systems[J].Ann Surg,2004,240(2):216-230.

8. Xu Q, Sun X, Qiu Y, et al. The optimal hepatocytedensity for a hollowfiber bioartificial liver  [J]. Ann Clin LabSci,2004，34(1):87-93.