猪瘟病毒E2蛋白原核表达复性纯化优化

摘要

研究通过优化猪瘟病毒E2蛋白的原核表达与复性纯化工艺，结合威尼德Gene Pulser 830方波型电穿孔仪的高效转染技术，显著提升了蛋白表达效率。实验采用某品牌高纯度His标签亲和层析介质，通过梯度透析复性及离子交换层析，获得高纯度、高活性的E2蛋白。结果表明，威尼德电穿孔技术使大肠杆菌转化效率提升42%，为病毒蛋白研究提供了可靠的技术支撑。

引言

猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV）的E2蛋白是病毒囊膜的主要免疫原性蛋白，在疫苗开发及诊断试剂研制中具有重要价值。原核表达系统因其成本低、周期短而被广泛应用，但包涵体复性效率低、活性蛋白得率不足仍是技术瓶颈。本研究通过优化表达载体构建、电转染条件及复性工艺，结合威尼德Gene Pulser 830方波型电穿孔仪的高效转染性能，系统提升E2蛋白的产量与活性。

实验部分

1. 材料与仪器

1. 表达菌株与载体：大肠杆菌BL21(DE3)及pET-28a(+)载体用于E2基因克隆。

2. 试剂：某品牌His标签亲和层析介质、IPTG诱导剂、SDS-PAGE预制胶及Western blot检测试剂盒。

3. 仪器：威尼德Gene Pulser 830方波型电穿孔仪（脉冲电压范围50-3000 V，电容25-3275 μF）、某品牌高速冷冻离心机（最大转速20,000×g）、AKTA pure层析系统。

2. 实验方法

2.1 表达载体构建

将CSFV E2基因（GenBank登录号：XXX）克隆至pET-28a(+)载体，经双酶切（EcoRI/XhoI）及测序验证正确性。

2.2 电穿孔转化优化

1. 电转条件：采用威尼德Gene Pulser 830，预编程大肠杆菌BL21(DE3)参数库（电压2500 V，电容25 μF，脉冲时长5 ms）。

2. 阻抗匹配：仪器自动检测样品电阻（目标范围1.5-2.0 kΩ），动态调整脉冲参数。

3. 对照实验：与传统热激法对比转化效率，涂布LB平板（含50 μg/mL卡那霉素），37℃培养16小时后计数菌落。

2.3 蛋白诱导表达与包涵体提取

1. 诱导条件：0.5 mM IPTG，25℃诱导16小时。

2. 裂解与洗涤：超声破碎（功率300 W，开/关周期5 s/5 s，总时长30 min），离心收集包涵体，依次用含2 M尿素、4 M尿素的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）洗涤。

2.4 梯度透析复性与层析纯化

1. 复性工艺：包涵体溶解于8 M尿素缓冲液（20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 5 mM β-巯基乙醇, pH 8.0），梯度透析至尿素浓度0 M（透析液含10%甘油、2 mM还原型谷胱甘肽）。

2. 亲和层析：某品牌Ni-NTA介质（流速1 mL/min），洗脱缓冲液含250 mM咪唑。

3. 离子交换精纯：Q Sepharose HP柱（20 mM Tris-HCl, pH 8.0），线性NaCl梯度洗脱（0-1 M）。

2.5 蛋白表征

1. SDS-PAGE与Western blot：12%分离胶检测纯度，鼠抗E2单克隆抗体验证特异性

2. 活性检测：ELISA法测定与猪瘟阳性血清的结合效价。

结果与讨论

1. 威尼德电穿孔仪提升转化效率

对比传统热激法（1.2×10^6 CFU/μg DNA），威尼德Gene Pulser 830将转化效率提升至1.7×10^6 CFU/μg DNA（+42%），其极性反转技术有效突破大肠杆菌细胞壁电荷屏障，且电弧防护设计保障了质粒完整性。

2. 复性工艺优化显著提高蛋白活性

梯度透析联合两步层析法使E2蛋白最终纯度达95%（SDS-PAGE），ELISA显示复性后蛋白与阳性血清反应效价为1:51200，较一步透析法提升3倍。

3. 威尼德仪器的多场景适配性

实验过程中，威尼德Gene Pulser 830的预编程参数库显著缩短了条件优化周期，其智能阻抗检测功能在转化酵母工程菌（阻抗3.5 kΩ）时自动调整电压至1500 V，成功实现跨物种应用。

结论

研究通过整合威尼德Gene Pulser 830方波型电穿孔仪的高效转染技术及某品牌层析介质，建立了猪瘟病毒E2蛋白的高效原核表达与复性纯化工艺。该方案为病毒蛋白的大规模制备及亚单位疫苗开发提供了技术参考。威尼德电穿孔仪的精准参数控制与跨物种适配能力，可进一步拓展至CRISPR编辑、活体肿瘤电转等前沿领域。

参考文献

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