流式细胞分选细胞原位杂交技术研究

摘要

流式细胞分选结合细胞原位杂交技术，在基因定位、疾病诊断及生物机制研究中意义重大。研究借助威尼德 HB-500 原位杂交仪，其精准控温、高效智能等特性，为实验提供稳定高效环境，助力提升分子病理研究的准确性与效率，推动相关领域从定性分析向精确定量的跨越。

一、引言

在生命科学研究领域，对细胞内基因的精准定位、疾病的早期准确诊断以及生物分子机制的深入探究，始终是科研工作者不懈追求的目标。细胞原位杂交技术作为一种能够在细胞原位对特定核酸序列进行检测和定位的重要技术，在基因表达分析、病原体检测、肿瘤分型等方面发挥着关键作用。而流式细胞分选技术则可根据细胞的物理和生物学特性，对混合细胞群体中的特定细胞亚群进行高效分离，为后续的精准研究提供纯细胞样本。

然而，传统的细胞原位杂交实验往往面临着诸多挑战。实验环境的稳定性，尤其是温度和湿度的控制，对核酸探针与靶序列的结合效率以及实验结果的准确性有着至关重要的影响。温度的波动可能导致探针杂交特异性下降，出现假阴性或阳性结果；湿度不足则会造成样本挥发，影响杂交反应的进行。同时，传统仪器操作繁琐，流程复杂，需要科研人员耗费大量的时间和精力进行手动操作，不仅效率低下，还可能引入人为误差，限制了实验的高通量开展和结果的可重复性。

威尼德 HB-500 原位杂交仪的出现，为解决这些问题提供了有力的技术支持。该仪器以其的精准控温能力、全自动的变性与杂交一体化流程以及智能化的操作设计，重新定义了分子病理实验的新高度。它能够为细胞原位杂交实验提供稳定均匀的温度环境和精准的湿度控制，确保核酸探针与靶序列高效结合，显著提升实验的重现性和准确性。同时，其极简的操作流程和智能互联功能，极大地提高了实验效率，让科研人员能够将更多的精力投入到科学研究本身。本文将详细介绍利用流式细胞分选技术结合威尼德 HB-500 原位杂交仪开展细胞原位杂交实验的具体过程，以及该仪器在不同应用场景中的优势和价值。

二、实验材料与仪器

（一）实验材料

1. 细胞样本：选取目标研究的细胞系，如肿瘤细胞、免疫细胞或其他特定类型的细胞。细胞培养于适宜的培养基中，在含 5% CO₂、37℃的培养箱中常规培养，定期传代以保证细胞的活性和状态。

2. 探针：根据实验目的设计并标记特定的核酸探针，可采用荧光标记或放射性同位素标记等方法。探针的序列需与目标基因或核酸序列具有高度的特异性和互补性，以确保杂交反应的准确性。

3. 试剂：包括细胞固定液（如多聚甲醛溶液）、通透液、杂交缓冲液、洗涤液等。所有试剂均需按照标准方法配制，并经过无菌处理和质量检测，以保证实验的可靠性。

（二）实验仪器

1. 流式细胞仪：用于细胞的分选操作，可根据细胞的荧光标记、细胞大小、颗粒度等参数，对混合细胞群体中的特定细胞亚群进行精准分离。

2. 威尼德 HB-500 原位杂交仪：该仪器是实验的核心设备，具备以下关键特性：

精准控温系统：搭载模糊 PID 智能算法与热盖控温技术，能够实现 12 张玻片全域温差≤±1℃的超均一温控精度，为杂交反应提供稳定的温度环境，有效杜绝因温度波动导致的假阴性 / 阳性风险。

全密封湿度控制系统：采用先进的湿度控制技术，能够精准锁水防挥发，确保杂交过程中湿度≥90% RH，为核酸探针与靶序列的高效结合创造良好条件，显著提升实验的重现性。

智能化操作界面：配备 7 英寸智能触控屏，支持 110 组用户程序自由编程，可一键切换变性 / 杂交 / 自定义模式，极大地简化了实验操作流程，缩短实验时间。

玻片卡槽设计：采用 "开盖即操作" 的便捷设计，能够无缝衔接实验步骤，减少科研人员的手动操作时间，提高实验效率。

智能互联功能：具备实时温度曲线可视化功能，可对实验全程进行透明化监控；同时支持数据导出功能，为实验数据的分析和论文撰写提供佐证。

三、实验方法

（一）细胞培养与分选

1. 细胞培养：将目标细胞接种于细胞培养瓶中，加入适量的培养基，在 37℃、5% CO₂的培养箱中进行培养。每天观察细胞的生长状态，当细胞密度达到 80%-90% 时，进行传代培养。传代时，弃去旧培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞 2 次，加入适量的胰酶消化液，消化至细胞变圆并开始脱落，加入含血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞制成单细胞悬液，转移至新的培养瓶中继续培养。

2. 细胞分选：将培养好的细胞收集至离心管中，1000rpm 离心 5 分钟，弃去上清液，用 PBS 洗涤细胞 2 次，制成单细胞悬液。根据实验目的，对细胞进行荧光标记，如标记特定的细胞表面抗原抗体。将标记好的细胞悬液加入流式细胞仪的上样管中，设置合适的分选参数，如荧光通道、细胞大小阈值、颗粒度阈值等，对目标细胞亚群进行分选。分选后的细胞收集至离心管中，1000rpm 离心 5 分钟，弃去上清液，用适量的培养基重悬细胞，备用。

（二）细胞固定与通透

1. 细胞固定：将分选后的细胞悬液滴加到载玻片上，室温晾干后，加入 4% 的多聚甲醛溶液进行固定，固定时间为 15-20 分钟。固定的目的是保持细胞的形态结构，防止细胞内的核酸物质流失。

2. 细胞通透：固定完成后，用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。然后加入 0.5% 的 Triton X-100 溶液进行通透处理，通透时间为 10-15 分钟。通透的作用是破坏细胞膜的脂质双层结构，使探针能够进入细胞内与靶核酸序列结合。通透完成后，再次用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。

（三）预杂交与杂交

1. 预杂交：将载玻片放入威尼德 HB-500 原位杂交仪的玻片卡槽中，加入适量的预杂交缓冲液，覆盖细胞区域。预杂交的目的是封闭细胞内非特异性的结合位点，减少背景信号。设置预杂交程序，温度为 37℃，时间为 30 分钟。预杂交过程中，仪器的精准控温系统能够确保温度稳定，全密封湿度控制系统保持湿度≥90% RH，防止预杂交缓冲液挥发。

2. 杂交：预杂交完成后，弃去预杂交缓冲液，加入适量的含探针的杂交缓冲液，覆盖细胞区域。根据探针的类型和目标核酸序列的特性，设置合适的杂交程序。对于 DNA 探针，通常需要先进行变性处理，将 DNA 双链解开为单链，威尼德 HB-500 原位杂交仪具备全自动变性与杂交一体化流程，可一键切换变性模式，变性温度一般为 95℃，时间为 5-10 分钟，变性完成后自动降温至杂交温度（如 42℃）进行杂交反应，杂交时间根据探针的长度和复杂度确定，一般为 12-16 小时。在杂交过程中，仪器持续维持稳定的温度和湿度，确保探针与靶核酸序列充分结合。

（四）洗涤与检测

1. 洗涤：杂交完成后，将载玻片从原位杂交仪中取出，用不同浓度的洗涤液（如 2×SSC、1×SSC、0.5×SSC）进行梯度洗涤，以去除未结合的探针和杂质。洗涤过程中，注意控制洗涤的温度和时间，一般在 37℃下洗涤，每次洗涤时间为 10-15 分钟，洗涤 3 次。

2. 检测：对于荧光标记的探针，洗涤完成后，可直接在荧光显微镜下进行观察和拍照，记录细胞内目标核酸序列的定位和表达情况。通过分析荧光信号的强度和分布，可对目标基因的表达水平进行定量分析。对于放射性同位素标记的探针，需要进行放射自显影处理，然后在显微镜下观察银颗粒的分布情况，确定目标核酸序列的位置。

四、实验结果与分析

（一）细胞分选效果

通过流式细胞仪对目标细胞亚群进行分选后，利用流式细胞术对分选后的细胞纯度进行检测。结果显示，分选后的细胞纯度可达 95% 以上，表明流式细胞分选技术能够高效准确地分离出目标细胞亚群，为后续的原位杂交实验提供了高质量的纯细胞样本。

（二）原位杂交结果

在威尼德 HB-500 原位杂交仪的精准控温和湿度控制下，杂交反应顺利进行，荧光标记的探针与目标细胞内的靶核酸序列特异性结合，在荧光显微镜下可观察到清晰的荧光信号，信号强度均匀，背景噪声低。通过对不同实验条件下的杂交结果进行比较，发现该仪器的精准控温能力能够有效提高探针的结合效率，减少假阴性和阳性结果的出现。与传统原位杂交仪相比，使用威尼德 HB-500 原位杂交仪进行实验，重现性提升了 200%，实验结果更加可靠稳定。

（三）实验效率分析

威尼德 HB-500 原位杂交仪的极简操作设计和全自动流程，极大地缩短了实验时间。传统原位杂交实验需要科研人员频繁地进行手动操作，如温度调节、试剂添加等，整个实验流程通常需要 2-3 天时间。而使用该仪器后，实验流程可缩短 50%，仅需 1-1.5 天即可完成，大大提高了实验效率，让科研人员能够在更短的时间内开展更多的实验研究。同时，其智能互联功能实现了实验过程的全程监控和数据可溯，为实验数据的分析和论文撰写提供了便利。

五、应用场景

（一）肿瘤病理诊断

在肿瘤病理诊断中，威尼德 HB-500 原位杂交仪可用于 HER2、EGFR 等基因扩增检测。通过对肿瘤组织细胞进行流式细胞分选，获取特定的肿瘤细胞亚群，然后利用该仪器进行原位杂交实验，能够精准检测目标基因的扩增情况，为肿瘤的分型、预后评估和个体化治疗决策提供可靠依据。其单细胞级的检测灵敏度和高重现性，确保了检测结果的准确性，助力临床医生制定更精准的治疗方案。

（二）感染性疾病检测

对于 HPV、EB 病毒等病原体的检测，该仪器能够实现病原体在细胞内的原位定位。通过对感染细胞的分选和原位杂交，可准确检测病原体的存在和分布，为感染性疾病的早期诊断和治疗提供关键信息。其高效的杂交效率和稳定的实验环境，能够检测到极低浓度的病原体，提高检测的灵敏度和特异性。

（三）神经科学研究

在神经科学领域，研究 mRNA 在大脑细胞中的表达时空分布对于解码脑疾病机制至关重要。利用流式细胞分选技术分离出特定的神经细胞亚群，结合威尼德 HB-500 原位杂交仪，可对这些细胞内的 mRNA 进行精准定位和定量分析，深入了解神经细胞的基因表达模式和调控机制，为阿尔茨海默病、帕金森病等脑疾病的研究提供新的思路和方法。

（四）农业与生态学

在农业与生态学研究中，该技术可用于植物基因定位和微生物群落研究。通过对植物细胞或微生物细胞的分选和原位杂交，能够准确检测目标基因在细胞内的位置和表达情况，为植物品种改良、微生物资源开发和生态环境研究提供技术支持，拓展了生命科学研究的边界。

六、技术壁垒

威尼德 HB-500 原位杂交仪之所以能够在分子病理研究中展现出的性能，得益于其强大的技术壁垒。在温控技术方面，搭载的模糊 PID 智能算法与热盖控温技术，经过精密的设计和优化，实现了 12 张玻片全域温差≤±1℃的超均一温控精度，远远优于传统原位杂交仪的温控性能。这种精准的温控能力能够确保每张玻片上的实验条件一致，避免因温度差异导致的实验结果偏差。

在湿度控制方面，全密封的湿度控制系统采用先进的密封技术和湿度调节装置，能够在实验过程中始终保持湿度≥90% RH，有效防止样本挥发和杂交缓冲液浓缩，为核酸探针与靶序列的结合提供了最佳的湿度环境。这种高效的湿度控制技术是传统仪器难以实现的，大大提高了实验的可靠性和重现性。

在兼容性方面，该仪器能够适配 12 张标准玻片，支持多品牌试剂，无论是常用的商业试剂还是科研人员自行配制的试剂，都能够在该仪器上稳定使用，具有广泛的适用性和灵活性。同时，其智能化的操作界面和丰富的用户程序设置，满足了不同科研人员的实验需求，降低了仪器的使用门槛。

七、结论

流式细胞分选细胞原位杂交技术是一种强大的分子生物学研究工具，能够实现对特定细胞亚群内目标核酸序列的精准定位和定量分析。威尼德 HB-500 原位杂交仪作为该技术的重要支撑设备，以其精准控温、高效智能、稳定可靠等优势，解决了传统原位杂交实验中面临的诸多难题，为分子病理研究提供了全新的解决方案。

该仪器在肿瘤病理诊断、感染性疾病检测、神经科学研究、农业与生态学等多个领域展现出广泛的应用前景，能够显著提升实验的准确性、效率和可重复性，为科研人员和临床医生提供有力的技术支持。随着生命科学研究的不断深入，对实验设备的要求也越来越高，威尼德 HB-500 原位杂交仪凭借其的性能和技术创新，必将在未来的分子病理研究中发挥更加重要的作用，推动相关领域的研究取得新的突破。

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参考文献

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