威尼德分子杂交仪：Western blot 实验原理及试验步骤

    经典实验步骤是将提取的蛋白电泳—转膜 --- 一抗孵育 --- 二抗孵育 --- 底物显色 --- 分析。我这几天几乎都在重复着这个过程，现在将自己试验过程记录下来，和大家一起分享，希望对新手有所帮助。

1.蛋白提取

     传统方法是(1)组织称重(2) 利用液氮、研钵粉碎组织块(3) 加入RIPA缓冲液，PMSF(4)匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃(5)加入PMSF冰上孵育30分钟，移入离心管4℃ 离心15分钟(6)上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存。一部分进行Bradford比色法 测定蛋白质浓度， 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度）进行电泳。

    小结 现在有许多公司提供即用的蛋白提取试剂或者试剂盒，如生兴生物 代理的Pierce系列产品，针对不同动物组织、真核等蛋白的提取试剂盒，以及RIPA缓冲液，PMSF等即用型试剂，免去了复杂繁琐的提取过程，高效方便。

2. 蛋白电泳(SDS-PAGE)

(1) SDS-PAGE凝胶配制

    SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用现成的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒

(2) 样品处理

    在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2X或5X的)。可以自行配制。

(3) 上样与电泳

    这一步主要是要注意电泳的电压选择和蛋白标准的选择，为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准 。

3. 转膜

    具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。实验中常选用PVDF膜和硝酸纤维素膜(NC膜)，但硝酸纤维素膜比较脆，推荐使用PVDF膜。转膜的效果用丽春红染色液或者考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

    小结   PVDF膜 及Western转膜液 质量都比较好，染色液的染色结果清晰，便于观察结果，所以推荐在试验中使用。

4. 封闭

    这一步一定要保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。加入Western封闭液封闭(脱脂奶粉 或者BSA)。一般采用BSA或者脱脂奶粉，建议最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比较好。

5. 一抗孵育

    参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗

6. 二抗孵育

    参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。

7. Westernblot 试剂盒显色及蛋白检测

    参考相关说明书，使用相应的荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒 自行配制显影液和定影液进行手工洗片。

8. 膜的重复利用

    如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。

9. 分析比较记录

主要试剂：丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠SDS溶液、浓缩胶缓冲液、TEMED原溶液、SDS-PAGE加样缓冲液、Tris-甘氨酸电泳缓冲液、转移缓冲液、丽春红染液储存液、脱脂奶粉、NaN3 0.02% 叠氮钠、Tween20、一抗、标记二抗、NBT、BCIP、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)、100mmol/L NaCl、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)、5mmol/L EDTA等。