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威尼德分子杂交仪:Western试验问题归纳与总结

更新时间:2022-07-23      点击次数:662

 Q1: PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么?

A1:一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,若反复洗几次后,蛋白容易掉下来,效果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合(注:常用的PVDF膜即带正电荷的尼龙膜),同时也有疏水作用,但相对较弱。这样的话,PVDF膜和蛋白接合较牢,不易脱落,效果较好。


    Q2:做组织样品的western blot的时候,处理样品有什么诀窍?

A2: 必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制剂),封闭剂一般5%脱脂奶粉。如果一抗为多克隆抗体,使用BSA也是不错的选择

    Q3:免疫组化和Western blot可以用同一种抗体吗?

A3: 免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western blotting,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。(限于单抗)

    Q4: 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上, 转移效率低怎么样解决?

A4: 可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液,可以参考《蛋白质技术手册》),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率;用优质的转移膜,或使用小孔径的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交联;低浓度胶,如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时间。

    Q5:Western blot哪种染色好?

A5: (1)阴离子染料是常用的,特别是氨基黑,脱色快,背景低检测极限可达到 1.5μg,考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度,但脱色慢,背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去,以便进行随后的氨基酸分析。缺点是:溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏,不能用于带正电荷的膜。灵敏度低。

(2)胶体金,灵敏度高,检测范围可到pg级,但染色比较稳定。

3)生物素化灵敏度位于12之间,可用于任何一种膜。

    Q6: Western检测基因转染后细胞培养上清中表达的目的蛋白(定性),分子量为20KD,浓度约为几百ng/ml。蛋白样品是否需浓缩、纯化?如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白?对小分子蛋白Western blot时需特别注意哪些条件?

A6:按照提供的浓度,如果做Western blot,是不用浓缩样品的. 对于20kd的小分子的蛋白,Western Blot中要注意的是:

    1、转移时的时间,

    2、转移时的电流或电压.

    3transfer buffer 中加20%的甲醇.

    4、可以用13-15%的分离胶.

    Q7: 半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小有一定关系,那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢?一般的条件是怎样的?

A7:半干转的电流大小是按照面积来算的,时间是根据蛋白分子大小定的;而湿转的话电流是恒定的,时间也是根据分子量而定。

    Q8: 采用生物素标记的二抗-SABC-DAB检测系统做western,非特异性的条带和背景很高,总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚,条带也很窄,可是越靠下面的条带越来越宽,有的跑得都连在一起,这是什么原因,如何解决?SDS—PAGE的时候恒压和恒流哪个好?

A8:非特异性的条带和背景高:可能性很多,如一抗,二抗,封闭的原因都可能。总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚,条带也很窄,可是越靠下面的条带越来越宽,有的跑得都连在一起,这种现象是正常的。另外,也可能积层胶有问题。SDS—PAGE的时候,恒压和恒流都可以用。

    Q9: 血清样品进行Western blot 分析,目的蛋白21kD,结果显色出来后,目的条带很淡,而白蛋白和IgG条带很浓,为什么?

A9:可能是因为白蛋白为67kD和目的蛋白相差较大,且其浓度较低,可以底物二氨基联苯胺和0.01%过氧化氢溶液显色的时间延长为30分钟,再用去离子水漂洗以终止反应;也可能是抗体的特异性不好。把封闭的时间延长,同时提高封闭液的浓度,可以减少以下背景噪音。同时洗的时候要*,而目的条带弱,说明浓度不足,如果不考虑后续功能的话,可过G-50(细)柱子,纯化靶蛋白,接着真空冷冻浓缩,可以得到很好的结果。

    Q10: Western转膜已经成功了,但是Marker泳道未见蛋白条带,其余各泳道均有清晰的蛋白条带,经考马斯亮蓝染胶,结果相同。经5%的脱脂牛奶封闭1小时45分钟后,进行一抗孵育(1200,建议起始浓度)过夜,二抗孵育5个半小时(1:2000),均在室温下,DAB显色,虽出现蛋白条带,但较弱,且出现非特异性条带。所用Marker可分离14-116KD的蛋白,是否因为marker有问题?一抗(多克隆抗体)、二抗的浓度及孵育的时间是否合适?封闭的时间是否太短?

A101. marker有可能被降解,也有可能是上样量太少。

     2. 建议一抗4℃孵育过夜,稀释比为1:100;如室温孵育,两小时即可。

     3. 二抗室温1小时,1:2000,或 4℃封闭过夜(室温两小时就够),一抗室温1小时,二抗室温1小时,最好是一抗4℃过夜(或室温2小时)1:200,二抗室温1小时1:2000,换ECL法。