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威尼德分子杂交仪:Western 中NC膜、PVDF膜、尼龙膜的差别

发布时间: 2022-07-23  点击次数: 425次

       硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,简称NC)NC膜在Northern BlotSouthern BlotWestern Blot中都需要用到,杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用,先将待测核酸结合到一定的固相支持物上,再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜。


PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的,膜孔径有大有小,随着膜孔径的不断减小。膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20000的蛋白选用0.45um的膜,小于20000的蛋白选用0.2um的膜。PVDF膜使用是需预处理,用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团,使其更容易与带负电的蛋白结合。PVDF膜具有较高的机械强度,是印迹法中的理想固相支持物材料。

尼龙膜是一种合成的长链聚酰胺薄膜,对核酸和蛋白质具有很强的结合能力,能代替硝酸纤维素薄膜用于分子印迹和杂交实验。NC膜、PVDF膜、尼龙膜的差别:尼龙膜是较理想的核酸固相支持物,有多种类型;硝酸纤维素膜是目前应用广的一种固相支持物,价格便宜;PVDF膜介于二者之间。

1. 就结合能力而言:

尼龙膜结合DNARNA能力可达480600μg/cm2,可结合短至10bp的核酸片段;硝酸纤维素膜结合DNARNA能力可达80100μg/cm2,对于200bp的核酸片段结合能力不强;PVDF膜结合DNARNA能力可达125300μg/cm2

2. 就温度适应性而言:

尼龙膜经烘烤或紫外线照射后,核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合;硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA,结合不牢固;PVDF膜结合牢固,耐高温,特别适合于蛋白印迹。就韧性而言:尼龙膜较强;硝酸纤维素膜脆,易破碎;PVDF膜较强。

3. 就重复性而言:

1)尼龙膜可反复用于分子杂交,杂交后,探针分子可经碱变性被洗脱下来;硝酸纤维素膜不能重复使用;PVDF膜可以重复使用。

2NC膜的使用也很简便,比如不需要甲醛预处理,只要在无离子水面浸润排出膜内气泡,再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了;比如NC膜很容易封闭,也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间,不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆,又容易卷,操作要小心,不适合用于需要多次重复清洗的用途。因为经不起多次折磨"。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径,通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜,小于20KD的话建议选择0.2um的,如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。另外还要注意选择纯的NC膜混有含醋酸纤维(CM)NC膜结合力会有所降低。

3)由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替,因此在封闭时最好使用较温和的Tween20,而且浓度不要超过0.3%(据说0.05%效果好)。一般而言,NC膜越纯,其蛋白结合能力就越高,所以要增加WB的灵敏度和分辨率,提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。如果NC膜搀杂一些醋化纤维素这在前面已经提到,会影响蛋白质结合。

4)与 纤维素膜相比,PVDF膜在蛋白质截留能力,机械强度和化学相容性上都更优越的性能。市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,PVDF膜结合量是100-200μg/cm2(而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍!)。但是PVDF膜最大的优点不仅于此:更好的机械强度和化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择;而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的,特别是需要做N端蛋白测序,在相当严酷"的清洗条件下,当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色,所以PVDF也是要做蛋白测序的选择。但不适合荧光。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理(不超过15)再用缓冲液平衡,才能用。

 


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