威尼德核酸分子杂交试验问题归纳与总结

常见问题

Q1：标记方法有哪几种？

A1：（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法
Q2：探针标记物的分类有几种？

A2：（1）探针标记物有放射性核素与非放射性物质两种。放射性核素标记敏感性高，可检测pg水平的核酸，但因不易长期保存，且存在放射性污染等问题，现已较少应用。

（2）非放射性物质常用的有生物素、地高X等，非放射性探针安全、稳定、操作方便并且经济，但敏感性较低，近年来，由于杂交信号检测方法的改进，检测的敏感性得到了很大提高。

Q3：怎样确定探针的浓度？

A3：总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。要获得较满意的敏感性，膜核酸分子杂交中放射性核素标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5-10 ng/ml和25-1000 ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5-5.0 μg/ml。

Q4：如何选择核酸分子杂交的最适温度？

A4：核酸分子杂交技术最重要的因素之一是选择最适的核酸分子杂交反应温度。若反应温度低于Tm 10-15 ℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30 ℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。最适复性温度：Tor =Tm–25 ℃苛刻复性温度：Ts = Tm – (10或15 ℃)非苛刻复性温度：Tns =Tm – (30或35 ℃)

 Q5：核酸杂交筛选寡核苷酸探针遵循哪些原则？

 A5：（1）长18-50 nt，较长探针杂交时间较长，合成量低；较短探针特异性会差些。

　   （2）碱基成分：G+C含量为40%-60%，超出此范围则会增加非特异核酸杂交。

　  （3）探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹"状结构。

　 （4）避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。

（5）一旦选定某一序列符合上述标准，最好将序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。

Q6：合成的寡核苷酸探针具有哪些优点？

A6：（1）由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点*杂交的时间比克隆探针短，如20 nt的寡核苷酸探针在浓度为100 ng/ml，靶序列为1-100 pg、1 kb片段时，达到核酸分子杂交只需10 min，而用2 kb的克隆探针在同样条件下达到*核酸分子杂交则需16 h。

（2）寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。

（3）一次可大量合成寡核苷酸探针（1-10 mg），使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。尽管克隆探针较特异，但通过细心筛选序列或选择相对长的序列（＞30 nt）也可设计出非常特异的寡核苷酸探针。常用的寡核苷酸探针有18-40个碱基，目前的合成仪可有效地合成至少50个碱基的探针。