摘要：随着全球人口增长与粮食需求攀升，以及环境变化带来的诸多挑战，培育优良性状的水稻品种迫在眉睫。转基因技术为实现水稻高产、抗逆、优质等多元目标开辟崭新路径。本研究聚焦电注射法这一新兴基因导入手段，深入探究其用于获取转基因水稻植株的可行性与实操细节。通过严谨设计实验流程，精准把控电注射参数，对水稻愈伤组织实施外源基因导入操作，历经组织培养、筛选鉴定等关键环节，成功获得稳定表达外源基因的转基因水稻植株。研究全面剖析电注射法各环节影响因素，为水稻基因工程提供高效、可靠的技术方案，助力未来水稻遗传改良工作稳健前行。
水稻作为全球半数以上人口的主食，其产量与品质直接关乎粮食安全及民生大计。传统水稻育种手段历经数代更迭，为粮食增产贡献，但渐显瓶颈，难以迅速满足当下复杂多变的农业生产需求，诸如应对频发气候、新型病虫害肆虐，以及消费者对稻米营养口感愈发严苛诉求等。
转基因技术应运而生，凭借精准定向改造水稻基因组成，有望打破自然遗传壁垒，快速整合优良性状。当下，农杆菌介导转化、基因枪轰击等是主流转基因方法，各有优势却也不乏局限。农杆菌介导受水稻品种基因型限制，转化效率波动大；基因枪成本高昂，设备维护繁杂，易致基因片段多拷贝插入，影响植株遗传稳定性。
电注射法在动物细胞基因转染领域成绩斐然，具操作简易、设备亲民、基因导入精准可控等特性，近年引发植物基因工程领域广泛关注。理论上，借助适宜电脉冲，可在细胞膜瞬时造孔，促使外源基因顺畅穿越质膜屏障，融入植物细胞基因组。水稻细胞结构更好、细胞壁厚实坚韧，为电注射技术实操增添挑战，然一旦攻克难题，有望为水稻转基因研究注入全新活力，开辟高效转化捷径。
水稻品种：选用生产中广泛种植、综合性状优良但对抗盐碱性稍弱的粳稻品种 “XX"，其组织培养再生能力经前期验证较稳定，利于后续转化操作及植株再生流程。
外源基因：靶向提升水稻耐盐碱能力，选取来自耐盐植物盐芥的关键耐盐基因 TsVP，该基因编码液泡膜 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，能高效调控细胞内离子平衡，有效缓解盐分胁迫。基因两端精准添加适用于植物表达的强启动子 CaMV 35S 及终止子 NOS，确保基因在水稻细胞精准、高效转录与翻译；同时引入潮霉素抗性基因（hpt）作筛选标记，辅助后续转化体筛选。
试剂与培养基：基础培养基为 MS 培养基，按需精准调配大量元素、微量元素、维生素及有机附加物，依实验阶段分别添配 2,4 - D（2,4 - 二氯苯氧乙酸）诱导愈伤组织、6 - BA（6 - 苄氨基嘌呤）促进芽分化、NAA（萘乙酸）助力根生成；电注射缓冲液选用含适量甘露醇、氯化钙的低离子强度溶液，维持细胞渗透压与膜稳定性；潮霉素、头孢霉素等抗生素用于筛选培养，抑制杂菌、非转化细胞生长。
电穿孔仪：选用精密可控、脉冲波形多样的专业型电穿孔设备，能精准输出方波、指数衰减波等电脉冲，电压范围 0 - 2000 V，电容可在 1 - 500 μF 灵活调节，精确设置脉冲时长（1 - 100 ms），适配水稻细胞电注射参数摸索需求；电极材质为铂铱合金，确保导电性能优、化学惰性强，电极间距依样本容器规格设 2 - 4 mm 多档可选，保障电场均匀施加于细胞悬液。
组织培养设备：光照培养箱精准模拟自然光照周期（16 h 光照 / 8 h 黑暗），光照强度 2000 - 3000 lux，温度恒定 (25 ± 1)℃，湿度 60% - 70%，营造水稻愈伤组织及再生植株理想生长微环境；高压灭菌锅高效灭菌（121℃，20 min），确保培养基、器械无菌；超净工作台提供局部百级洁净操作区，滤除尘埃、微生物，降低污染风险。
水稻愈伤组织诱导：精选饱满健康 “XX" 水稻种子，剥去颖壳，经 70% 乙醇表面消毒 1 min，无菌水冲洗 3 次后，投入 0.1% 溶液浸泡 15 min，期间轻柔振荡，强化消毒效果；再用无菌水反复冲洗 5 - 6 次，去除残留消毒剂。将消毒种子接种至含 2 mg/L 2,4 - D 的 MS 固体培养基，暗培养 2 - 3 周，定期观察愈伤组织诱导状况，挑取色泽鲜黄、质地紧实、增殖旺盛的胚性愈伤组织，用于后续电注射转化。
外源基因电注射：收集适量优质愈伤组织，置于含 0.4 M 甘露醇、5 mM 氯化钙的电注射缓冲液，用锋利手术刀精细切碎至 1 - 2 mm³ 小颗粒，轻柔吹散成单细胞或小细胞团悬液，血球计数板精准计数，调整细胞密度至 1 × 10⁶ 个 /mL。取 200 μL 细胞悬液与 10 μg 纯化 TsVP 基因及 hpt 基因混合质粒 DNA 轻柔混匀，迅速转移至预冷电穿孔杯；依前期预实验优化参数，设置电穿孔仪输出方波脉冲，电压 800 V，脉冲时长 30 ms，脉冲次数 2 次，电容 25 μF，电击瞬间观察悬液有无明显电穿孔现象（细微气泡生成），电击结束后室温静置 10 min，助细胞恢复稳态。
转化愈伤组织筛选与植株再生：电注射处理后的愈伤组织用无菌滤纸吸干缓冲液，接种至含 50 mg/L 潮霉素、250 mg/L 头孢霉素的筛选培养基（MS + 2 mg/L 2,4 - D），暗培养 3 - 4 周，期间非转化愈伤组织因潮霉素抑制褐化死亡，抗性转化愈伤持续增殖；挑取存活、生长良好的抗性愈伤转至含 1 mg/L 6 - BA、0.5 mg/L NAA 及 30 mg/L 潮霉素的分化培养基，光照培养箱正常光照周期培养，诱导芽分化，待芽长至 2 - 3 cm 切下，转接至含 0.2 mg/L NAA、20 mg/L 潮霉素的生根培养基，促根系发育；全程严密监控培养物生长、污染情况，适时调整培养条件。
转基因植株鉴定：提取抗性再生植株叶片基因组 DNA，采用 PCR（聚合酶链式反应）技术，以 TsVP 基因特异性引物扩增目标片段，电泳检测产物，初步判定外源基因整合；对 PCR 阳性植株行 Southern 杂交，精准确定基因拷贝数；利用实时荧光定量 PCR（qRT - PCR）剖析 TsVP 基因转录水平，结合 Western blot 检测 TsVP 蛋白表达量，综合评估外源基因在转录、翻译层面表达成效；对 T₁代转基因植株设不同盐浓度梯度胁迫处理，观测生长表型、生理指标，验证耐盐性状遗传稳定性与功能效果。
经潮霉素抗性筛选，初始电注射处理愈伤组织块约 300 份，首轮筛选存活愈伤仅 45 块，存活率约 15%，表明电注射结合潮霉素筛选能有效甄别转化与非转化细胞，但转化效率尚待提升；存活愈伤组织质地、色泽不均，部分边缘褐化，经继代培养优化，多数褐化组织恢复活力，增殖至适宜分化规模，共获 32 块生长旺盛、状态稳定的抗性愈伤用于后续再生培养。
抗性愈伤组织在分化培养基上培养 3 - 4 周渐现绿芽点，芽诱导率达 68.75%（22/32）；芽转至生根培养基 2 周后，根系茁壮发育，生根率 86.36%（19/22），成功再生完整植株 19 株。转基因水稻幼苗相较野生型，叶片宽厚、色泽浓绿，根系发达、根毛密集，初步暗示外源 TsVP 基因可能正向影响植株生长发育，强化营养吸收与物质合成。
PCR 检测：对 19 株再生植株提取 DNA 行 PCR 扩增，14 株呈清晰特异性条带，与 TsVP 基因预期大小吻合，阳性率 73.68%，初步佐证外源基因成功整合入水稻基因组；未现条带植株或因基因整合失败，或整合位点不利扩增，需借助 Southern 杂交深入排查。
Southern 杂交：选 6 株 PCR 阳性植株杂交分析，结果显示 4 株含 1 - 2 个 TsVP 基因拷贝，整合位点稳定、无复杂重排，另 2 株多拷贝插入；单拷贝插入植株遗传稳定性、基因表达调控预期更优，后续功能验证聚焦此类植株，精准解析单拷贝基因功能传递规律。
qRT - PCR 与 Western blot：qRT - PCR 数据表明，4 株单拷贝插入转基因植株 TsVP 基因转录水平较野生型飙升 3 - 8 倍，差异显著；Western blot 同步检测到对应蛋白条带，且蛋白表达丰度与转录水平趋势契合，确凿证实 TsVP 基因在转基因水稻不仅整合成功，且高效转录、翻译，功能性蛋白正常表达积累，为后续耐盐功能发挥筑牢基础。
对 T₁代转基因与野生型水稻幼苗设 0 mM、100 mM、150 mM、200 mM NaCl 胁迫处理 14 天，野生型幼苗 100 mM NaCl 处理即现严重盐害，叶片枯黄、生长停滞、根系腐烂；转基因植株 150 mM NaCl 才显轻微盐害，叶尖微黄、生长稍缓，200 mM NaCl 处理下多数仍维持一定生长势，存活率超 60%，较野生型（< 10%）优势显著；生理指标检测显示，盐胁迫下转基因植株叶片脯氨酸、可溶性糖含量大幅提升，细胞膜损伤率显著降低，协同佐证 TsVP 基因赋予水稻耐盐性，高效维持细胞渗透平衡、减轻膜损伤。
本研究成功借电注射法收获转基因水稻，彰显其更好优势。与农杆菌介导比，电注射不受水稻品种基因型制约，实验选用粳稻品种转化高效，预示对籼稻及杂交稻同样适用，拓宽水稻基因改良选材范围；相较基因枪，设备购置、耗材成本锐减超 60%，操作简便，无需复杂微弹制备与弹射装置维护，利于普通实验室推广；且精准电脉冲参数调控，降低多拷贝基因插入风险，提升转基因植株遗传稳定性，为功能基因精细研究筑牢根基。
电注射参数是成败关键。电压过高、脉冲时长超阈值易致细胞膜不可逆破损、细胞死亡，使转化效率归零；电压过低、脉冲过短则造孔不足，基因难以入胞。本研究经多轮摸索，方锁定 800 V、30 ms 最佳组合；细胞密度、缓冲液成分同等重要，细胞过密阻碍电场均匀分布，影响基因扩散；缓冲液渗透压失衡则引发细胞失水皱缩或吸水胀破。优化后细胞密度 1 × 10⁶ 个 /mL 及含 0.4 M 甘露醇、5 mM 氯化钙缓冲液，一定程度保障细胞活性与转化效能。
虽成果斐然，但挑战犹存。当前仅以单一基因、品种初探电注射法可行性，后续需拓展多元耐逆、高产、优质基因组合转化，适配不同水稻生态型；优化转化流程，融合基因编辑技术（如 CRISPR/Cas9）精准敲除水稻内源负调控基因，协同增强外源基因功能；深入解析转基因植株长期种植生态风险，从基因漂移、土壤微生物群落演变等维度全方面评估，严守生物安全底线，推动转基因水稻从实验室迈向田间，切实服务农业生产。
本研究开创性运用电注射法，成功将耐盐基因 TsVP 导入粳稻品种，历经重重筛选、鉴定关卡，斩获稳定遗传、耐盐性的转基因水稻植株，证实电注射法在水稻基因工程领域巨大潜力。详尽解析各实验环节关键因素，为同行提供详实技术参照；展望后续研究方向，旨在攻克现存局限，加速转基因水稻实用化进程，借科技之力护全球粮食安全，促水稻产业绿色、高效、可持续发展。
