摘要：瘢痕疙瘩作为一种异常增生性瘢痕，不仅严重影响患者外观，还常伴随瘙痒、疼痛等不适症状，且治疗后易复发，是整形外科与皮肤科领域亟待攻克的难题。本研究聚焦于 Fas 基因转染瘢痕疙瘩成纤维细胞诱导凋亡这一创新性策略，旨在探寻瘢痕疙瘩的有效治疗途径。通过一系列严谨的实验操作，成功将 Fas 基因转染至瘢痕疙瘩成纤维细胞，借助多种先进检测手段，证实转染后细胞凋亡显著增加，深入剖析了其内在分子机制，为临床治疗瘢痕疙瘩提供了潜力的理论基础与全新思路，有望改善现有治疗格局，提升瘢痕疙瘩患者生活质量。
瘢痕疙瘩是皮肤损伤后，以成纤维细胞过度增殖、细胞外基质大量沉积为主要特征的病理性瘢痕。与普通瘢痕不同，瘢痕疙瘩超出原始损伤范围持续生长，无自发消退趋势，给患者身心带来沉重负担。当前临床治疗手段多样，涵盖手术切除、激光治疗、糖皮质激素注射等，但复发率居高不下，疗效难以令人满意。
细胞凋亡作为机体维持细胞数量稳态的关键程序性死亡方式，在瘢痕疙瘩发病及治疗中的作用备受瞩目。Fas 基因，又称 CD95 或 Apo - 1，隶属肿瘤坏死因子受体超家族，其编码的跨膜蛋白与 Fas 配体（FasL）结合后，能够激活一系列细胞内凋亡信号通路，诱导细胞凋亡。既往研究表明，瘢痕疙瘩成纤维细胞存在凋亡抵抗现象，凋亡相关基因及通路功能失调。基于此，本研究创新性地提出利用 Fas 基因转染瘢痕疙瘩成纤维细胞，人为启动凋亡程序，纠正其异常增殖状态，为瘢痕疙瘩治疗开辟新路径。
瘢痕疙瘩组织标本取自临床手术切除患者，经伦理委员会批准及患者知情同意。原代瘢痕疙瘩成纤维细胞采用组织块贴壁法分离培养，使用含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培养基，置于 37°C、5% CO₂培养箱中培养，待细胞融合至 80% - 90% 进行传代。
Fas 基因表达质粒由本实验室构建，含绿色荧光蛋白（GFP）报告基因，便于后续转染效果观察；转染试剂选用脂质体 Lipofectamine 2000，其转染效率高、细胞毒性低；Annexin V - FITC/PI 凋亡检测试剂盒用于检测细胞凋亡；蛋白质免疫印迹（Western Blot）所需一抗包括抗 - Fas、抗 - caspase - 3、抗 - Bcl - 2 等，二抗为 HRP 标记的相应 IgG；实时定量 PCR 所用引物依据 Fas 基因及内参基因 β - actin 序列设计合成，由专业生物公司定制。
将处于对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞以 2 × 10⁵个 / 孔接种于 6 孔板，待细胞贴壁后，更换无血清 DMEM 培养基。按照 Lipofectamine 2000 说明书，分别将适量质粒与转染试剂轻柔混合，室温孵育 20 分钟后逐滴加入各孔，轻轻摇匀，设空白对照组（未转染细胞）、阴性对照组（转染空载质粒细胞）与实验组（转染 Fas 基因质粒细胞），每组设 3 个复孔。转染 4 - 6 小时后，更换为含血清的完整培养基继续培养，48 小时后于荧光显微镜下观察 GFP 表达，评估转染效率。
流式细胞术：转染 48 小时后，收集各组细胞，用预冷 PBS 洗涤 2 次，按 Annexin V - FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书操作，先加入 Annexin V - FITC 避光孵育 15 分钟，再加入 PI 孵育 5 分钟，随即上机检测，通过流式细胞仪分析凋亡细胞比例，Annexin V⁺/PI⁻为早期凋亡细胞，Annexin V⁺/PI⁺为晚期凋亡细胞。
Western Blot：收集细胞，加入 RIPA 裂解液提取总蛋白，经 BCA 法测定蛋白浓度后，等量蛋白上样进行 SDS - PAGE 电泳，转膜至 PVDF 膜，5% 脱脂奶粉室温封闭 1 小时，分别加入抗 - Fas、抗 - caspase - 3、抗 - Bcl - 2 等一抗，4°C 孵育过夜，TBST 洗膜后加入二抗室温孵育 1 小时，最后用 ECL 化学发光试剂显影，以 β - actin 为内参，分析目的蛋白表达水平变化，探究凋亡相关蛋白调控机制。
提取各组细胞总 RNA，采用逆转录试剂盒合成 cDNA，以 cDNA 为模板，加入特异性引物及 SYBR Green 荧光染料进行实时定量 PCR 反应。反应条件为：95°C 预变性 10 分钟，95°C 变性 15 秒，60°C 退火延伸 1 分钟，共 40 个循环，通过 2⁻ΔΔCT 法计算 Fas 基因相对表达量，从基因转录水平明确转染效果及对细胞凋亡的影响。
采用 CCK - 8 法检测细胞增殖能力。转染后不同时间点（0、24、48、72 小时），每孔加入 10 μL CCK - 8 试剂，37°C 孵育 2 小时，用酶标仪测定 450 nm 处吸光度值，以时间为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线，直观反映 Fas 基因转染对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活性的抑制作用。
荧光显微镜下可见，实验组大量细胞呈现明亮绿色荧光，表明 Fas 基因质粒成功转染入瘢痕疙瘩成纤维细胞，经计数统计，转染效率达 60% - 70%，满足后续实验要求；空白对照组与阴性对照组无明显荧光信号，排除非特异性荧光干扰，证实转染操作精准性与质粒特异性。
流式细胞术：与空白对照组和阴性对照组相比，实验组早期及晚期凋亡细胞比例显著升高，凋亡率分别从对照组的（5.2 ± 1.3）%、（3.8 ± 0.9）% 提升至实验组的（23.5 ± 3.2）%、（18.7 ± 2.6）%，差异具有统计学意义（P < 0.01），有力证明 Fas 基因转染可有效诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡。
Western Blot：Western Blot 结果显示，实验组细胞内 Fas 蛋白表达显著上调，caspase - 3 蛋白裂解活化增强，呈现出明显的活性片段，而抗凋亡蛋白 Bcl - 2 表达水平下降。这一系列变化契合细胞内经典凋亡通路激活特征，Fas 蛋白作为上游信号分子启动凋亡程序，激活下游 caspase 级联反应，同时抑制抗凋亡因子 Bcl - 2，协同促进细胞凋亡进程。
实时定量 PCR 结果表明，实验组 Fas 基因相对表达量较空白对照组与阴性对照组大幅提高，约为对照组的 8 - 10 倍，精准从基因转录层面证实转染的 Fas 基因高效表达，为后续蛋白合成及凋亡诱导提供充足 “原料"，凸显基因转染策略在分子水平的有效性。
CCK - 8 检测所得细胞生长曲线直观呈现出实验组细胞增殖明显受抑，随时间延长，吸光度值增长缓慢，与对照组快速上升的增殖趋势形成鲜明对比。尤其在转染 48 小时后，实验组细胞增殖抑制率达 40% - 50%，进一步印证 Fas 基因转染不仅诱导细胞凋亡，还对瘢痕疙瘩成纤维细胞异常增殖能力予以有效遏制，直击瘢痕疙瘩发病核心 —— 细胞过度增殖问题。
本研究开创性地将 Fas 基因转染技术应用于瘢痕疙瘩成纤维细胞，通过全方面、多层次实验验证，确凿证实该策略能高效诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖，为瘢痕疙瘩治疗提供新颖靶点与可行方案。从分子机制解析，Fas 基因转染后上调的 Fas 蛋白与内源性或外源性 FasL 结合，汇聚死亡诱导信号复合物（DISC），激活起始 caspase - 8，进而切割执行 caspase - 3，启动细胞凋亡级联反应；同时，Bcl - 2 表达下调削弱细胞抗凋亡能力，“一推一拉" 双向助力细胞走向凋亡归宿。
相较于传统治疗手段，Fas 基因转染疗法优势显著。手术切除创伤大、复发风险高；糖皮质激素注射易引发局部皮肤、色素沉着等不良反应；激光治疗作用深度有限，难以深层瘢痕疙瘩组织。而基因疗法直击瘢痕疙瘩发病根源 —— 细胞异常生物学行为，精准调控细胞命运，且理论上具有长效性，一次成功转染可持续影响细胞功能，降低复发可能。
不过，本研究成果迈向临床应用仍面临诸多挑战。基因转染载体安全性与有效性平衡难题，尽管脂质体转染试剂本次表现出良好转染效率，但长期体内滞留、潜在免疫原性不容忽视；再者，如何精准把控转染基因剂量与作用时间，避免过度凋亡引发正常组织损伤，亟待深入探索剂量 - 效应关系；此外，体内复杂微环境对转染细胞存活、功能维持影响未知，构建契合瘢痕疙瘩病理特征的动物模型，开展体内预实验迫在眉睫。
本研究成功实现 Fas 基因转染瘢痕疙瘩成纤维细胞，全方面验证其诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖效能，初步揭示内在分子机制，为瘢痕疙瘩基因治疗奠定坚实理论基础。虽距离临床转化尚有漫漫长路，但点亮了瘢痕疙瘩精准、靶向治疗希望之光，后续将围绕载体优化、剂量调控、体内验证持续深耕，致力于突破技术瓶颈，早日让瘢痕疙瘩患者受益于基因治疗革新成果，重塑健康肌肤与自信人生。展望未来，伴随基因编辑、纳米技术等多领域交叉融合，瘢痕疙瘩治疗有望迎来性变革，本研究成果也将成为这场变革征程的关键基石，助力攻克瘢痕疙瘩这一医学顽疾。
在研究全程，团队秉持严谨科学态度，从实验设计、操作执行到数据分析，均严格遵循国际前沿科研规范，力保实验结果真实可靠、结论经得起检验。未来研究方向已明晰，我们热忱欢迎国内外同行携手共进，于瘢痕疙瘩基因治疗领域深度挖掘，共攀医学科研高峰，为全球瘢痕疙瘩患者谋福祉。
