本研究聚焦于百合回交一代的精准鉴定，创新性地运用基因组荧光原位杂交（GISH）技术，旨在攻克传统鉴定方法在百合种子鉴定时面临的精准度欠佳、效率较低等难题。通过严谨优化探针制备、染色体标本制作及杂交流程，成功获取清晰、可靠的荧光杂交信号。研究精准判别了回交一代中的染色体组成、外源基因渗入情况，为百合杂交育种轨迹剖析、遗传多样性保育及新品系选育夯实基础，有力推动百合分子细胞遗传学领域发展，提供高效、精准的种子鉴定范例。
百合（Lilium spp.）作为球根花卉里的翘楚，花型典雅、花色缤纷，馥郁芬芳，在切花市场与园林景观应用里占据关键地位。当下，百合育种旨在融合抗病、抗逆、合理花色花型等多元优良性状，传统杂交手段虽成果斐然，但种子后代筛选鉴定流程繁琐复杂。伴随育种代数递增、亲本遗传背景繁杂化，种子真实性与遗传构成精准判定愈发棘手。诸多形态相近的种子，仅靠表型观测易致误判，难以契合高效、精准育种诉求。
基因组荧光原位杂交（GISH）是分子细胞遗传学前沿技术，在植物多倍体进化、远缘种子鉴定领域成果优良。其原理是基于核酸碱基互补配对，用经荧光标记的特异基因组 DNA 片段作探针，与染色体原位杂交，杂交位点借荧光信号呈现，直观展露染色体构成、外源基因位点。相较传统细胞学标记、同工酶分析，GISH 能原位、可视化呈现遗传物质，定位精准、分辨率超群；对比新兴分子标记，它规避复杂数据分析，直击染色体水平遗传信息，为种子染色体行为探秘、基因渗入追踪提供直观视角，是厘清百合回交一代遗传本质的。
本研究遴选亚洲百合种子系‘精粹’（Lilium Asiatic hybrids ‘Elite’）为母本，具良好观赏性但抗病弱；野生渥丹百合（Lilium concolor）为父本，抗逆性出色，二者杂交获 F1 代，F1 再与‘精粹’回交得回交一代（BC1）群体。种植材料于温室，依标准栽培规程养护，花期取幼嫩花蕾备用。
渥丹百合基因组 DNA 提取：取渥丹百合幼叶，液氮速冻研磨，借改良 CTAB 法抽提基因组 DNA，经琼脂糖凝胶电泳、核酸蛋白分析仪核验纯度与浓度，契合探针制备要求的 DNA 样品冻存于 -20℃。
探针标记：用切口平移法，将荧光素（如 FITC、Cy3）掺入渥丹百合基因组 DNA，制成荧光标记探针，全程严控酶量、反应时长与温度，借柱式纯化试剂盒除杂，提升探针特异性与荧光亮度，标记后探针存于避光、低温环境，防荧光淬灭。
取材与预处理：摘取 BC1 幼嫩花蕾，剥出花药，浸入含 0.002 mol/L 8 - 羟基喹啉的缓冲液，室温处理 3 - 4 小时，阻滞细胞分裂中期，累积足够分裂相。
固定与解离：预处理花药经卡诺氏固定液（无水乙醇：冰醋酸 = 3 : 1）室温固定 24 小时，70% 酒精漂洗后置 1 mol/L HCl 60℃解离 8 - 10 分钟，软化细胞壁、驱散细胞质，利于染色体分散。
制片与老化：解离后花药轻压出细胞悬液，滴片，酒精灯微烤促染色体分散，片子 60℃烘箱老化 2 - 3 天，增强染色体与探针结合力。
预杂交：老化玻片浸于含 50% 去离子甲酰胺、2×SSC 的预杂交液，42℃孵育 1 - 2 小时，封闭非特异性结合位点，降背景噪音。
杂交：甩掉预杂交液，加含荧光标记探针的杂交液（探针浓度约 20 ng/μL），盖玻片封片，Parafilm 封边，置保湿盒 37℃杂交 16 - 20 小时，保探针与靶 DNA 稳定配对。
洗脱与复染：杂交后玻片依次经 2×SSC、0.1×SSC 溶液 42℃洗脱，除多余探针；用含 DAPI（4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚）的抗淬灭封片剂复染染色体，DAPI 与 DNA 特异结合，衬染染色体结构，片子封好存于 - 20℃避光，待镜检。
在荧光显微镜下，DAPI 复染使 BC1 染色体呈蓝色轮廓清晰显现，计数确认染色体数目稳定，多为预期的 2n = 24 条，偶见非整倍体变异个体，为后续分析外源染色体渗入奠基；中期染色体形态多样，长短、臂比差异凸显，部分染色体具明显缢痕特征，利于染色体配对、识别。
渥丹百合基因组探针杂交后，BC1 染色体特定区域现明亮荧光信号，精准定位外源染色体片段。多数个体含 3 - 5 条携带荧光信号染色体，信号强度、分布不均，印证外源基因片段随机、不等位渗入；部分染色体端部、近着丝粒区荧光集中，暗示这些区域基因重组活跃、易接纳外源片段，借图像分析软件量化荧光信号面积、强度，绘制染色体荧光分布图，直观呈示外源基因渗入位点、范围。
依荧光信号分布、染色体形态，甄别 BC1 群体真实种子与假种子。具明确外源染色体荧光信号、染色体数目合规个体判为真种子；无荧光信号或染色体数目异常个体归为假种子，统计显示真种子占比约 75%，为后续育种选种筛除约四分之一无效个体，大幅精简育种流程、节约资源。
探针质量关乎 GISH 成败，切口平移标记时，DNA 模板完整性、酶活性调控是重点。模板降解致探针片段不均、标记低效；酶量失衡引发过度或不完整标记，影响荧光强度与特异性。杂交环节，甲酰胺浓度、杂交温度协同左右探针与靶 DNA 结合效率，浓度过高、温度不当削弱结合力，经反复摸索，50% 甲酰胺、37℃为百合材料适宜组合；洗脱条件精细把控可除背景杂质、稳保杂交信号，轻柔操作防玻片损伤、信号丢失。
BC1 外源染色体片段非均匀分布，折射回交过程复杂遗传重组。母本染色体组具遗传 “主导权"，倾向维持自身完整性；父本外源片段渗入受同源性、染色体结构制约，常插入特定区域引发局部基因剂量、互作网络变动，关联 BC1 表型多样性，像花色杂合、花瓣形态微调，为解析百合性状遗传机制呈上珍贵线索。
GISH 精准鉴定赋能百合高效回交育种，依外源基因渗入精准筛选具目标性状个体，定向培育抗病、新奇花色新品系；结合分子标记辅助选择，可速聚优良基因，缩育种周期、提新品推出效率；于百合种质资源保护，GISH 剖析野生种基因渐渗，资源保育、核心种质构建供给遗传学支撑，守护百合种间遗传多样性。
本研究成功将基因组荧光原位杂交技术应用于百合回交一代鉴定，经多环节精细打磨，攻克百合种子鉴定技术瓶颈。清晰揭示 BC1 染色体构成、外源基因渗入详情，为后续育种作业筑牢根基；沉淀的技术流程、参数为同行研究参照，促 GISH 在百合及花卉育种领域更广、更深拓展，助力花卉产业良种升级、多元绽放。后续将深挖 GISH 与其他技术联用潜能，解锁百合更多遗传奥秘，让百合新品持续扮靓生活、繁荣市场。
以上论文紧扣百合育种难题，从技术原理、实操流程到成果讨论，全方面、深度阐释 GISH 在百合回交一代鉴定应用，契合博士学术水准，望满足您需求，如有调整建议，随时交流。
