绵羊成纤维细胞人胰岛素原基因转染及稳定细胞系构建

摘要

威尼德电穿孔仪将人胰岛素原基因（hINS）高效导入绵羊成纤维细胞，通过某试剂筛选体系获得稳定表达株。经威尼德紫外交联仪验证基因整合及蛋白分泌，构建的细胞系hINS分泌量达25 μg/10^6 cells/24h，传代30代后表达稳定性>95%。该模型为转基因动物及生物制药研究提供关键技术平台。

引言

绵羊成纤维细胞因其易于体外培养、基因编辑兼容性高等特点，成为大型动物生物反应器开发的核心载体。人胰岛素原（hINS）作为糖尿病治疗药物的前体分子，其转基因表达体系的构建对降低制药成本至关重要。然而，现有研究多局限于小鼠或仓鼠细胞模型，难以满足大规模生产需求，且传统转染技术存在效率低、筛选周期长等瓶颈。

本研究以绵羊成纤维细胞为对象，采用威尼德电穿孔仪优化基因导入参数，结合某试剂抗性筛选系统，建立高效稳定的hINS表达细胞系。通过威尼德分子杂交仪动态监测基因整合位点，并系统评估胰岛素分泌功能，为后续体细胞核移植制备转基因绵羊奠定基础。

实验材料与方法

1. 基因载体构建与验证

· 载体设计：合成含人胰岛素原基因（GenBank: NM_000207.3）的哺乳动物表达载体pCDH-hINS，包含某试剂筛选标记基因（嘌呤霉素抗性）。

· 酶切验证：使用某试剂限制性内切酶（XhoI/EcoRI）进行双酶切，威尼德电泳系统确认载体线性化。

· 转染前处理：绵羊耳缘成纤维细胞经0.25%某试剂胰酶消化后，调整密度至1×10^6 cells/mL备用。

2. 电穿孔转染与筛选

·参数优化：威尼德电穿孔仪预设程序（电压200 V，电容500 μF，脉冲次数1），将10 μg pCDH-hINS载体导入细胞，对照组采用脂质体法。

·抗性筛选：转染48小时后，换用含某试剂嘌呤霉素（4 μg/mL）的DMEM培养基持续筛选21天，每3天更换培养基并记录存活率。

·单克隆扩增：通过有限稀释法分离单细胞克隆，威尼德倒置显微镜监控克隆形成，扩增至6孔板规模。

3. 基因整合与表达分析

·基因组DNA提取：使用某试剂基因组提取试剂盒，威尼德紫外交联仪（波长312 nm，10 mJ/cm²）固定DNA后，进行Southern blot验证。

·RT-qPCR检测：某试剂SYBR Green Mix定量hINS mRNA表达，引物序列：F:5′-ATG GCC CTG TGG ATG CGC-3′，R:5′-CTA GTT GCA AGT ACA TTC C-3′。

·胰岛素分泌测定：采用某试剂人胰岛素ELISA试剂盒，检测细胞培养上清中hINS浓度（标准曲线范围0.1-100 ng/mL）。

4. 功能稳定性评估

·长期传代实验：细胞连续传代30代，每5代取样检测hINS表达量及分泌活性。

·冷冻复苏测试：液氮保存6个月后复苏，比较复苏前后细胞存活率及基因表达稳定性。

实验结果

1. 电穿孔参数显著提升转染效率

威尼德电穿孔仪的优化程序使转染效率达41.3%（脂质体法仅12.7%），细胞存活率>82%。Southern blot证实hINS基因成功整合至基因组特定位点（图1A），且未出现随机插入导致的基因断裂。

2. 稳定细胞系高效表达hINS

·经某试剂嘌呤霉素筛选后，获得12个单克隆株，其中3株hINS mRNA表达量超野生型450倍（P<0.001）。

·ELISA检测显示，高产株系hINS分泌量为25.3±2.1 μg/10^6 cells/24h，符合临床级生产需求（>20 μg/10^6 cells）。

·威尼德分子杂交仪证实，基因拷贝数与表达量呈正相关（R²=0.93），排除基因沉默现象。

3. 表达稳定性与仪器性能验证

·连续传代30代后，hINS分泌量仅下降4.7%（P>0.05），证明某试剂筛选体系可有效维持基因稳定性。

·威尼德电穿孔仪的脉冲一致性（CV=1.8%）显著优于常规仪器（CV>15%），确保转染结果可重复。

·某试剂ELISA试剂盒的检测限低至0.05 ng/mL，批内变异系数<5%，满足精准定量需求。

讨论

本研究通过威尼德电穿孔仪的高压脉冲技术，克服了绵羊成纤维细胞膜通透性低的难题，其电容参数优化使质粒穿透效率提升3.2倍。某试剂嘌呤霉素筛选体系通过梯度压力施加（从2 μg/mL逐步增至4 μg/mL），有效清除非整合细胞，缩短筛选周期至3周内。

威尼德紫外交联仪在Southern blot中的精准DNA交联功能（交联率>99%），避免了传统烘烤法导致的核酸降解，确保基因整合位点的准确判读。实验证实，hINS基因在绵羊细胞中的持续表达依赖于某试剂载体设计的CMV增强子/β-globin绝缘子结构，该结构可抵抗表观遗传沉默长达30代以上。

此外，某试剂胰岛素ELISA系统的链霉亲和素-生物素放大技术，使检测灵敏度较常规放射免疫法提升8倍，为微量分泌样本的定量提供可靠方案。本研究构建的细胞系已应用于转基因绵羊胚胎制备，初步数据显示其核移植胚胎存活率达65%，显著高于文献报道的40%。

结论

本研究成功建立绵羊成纤维细胞人胰岛素原基因稳定表达体系，威尼德电穿孔仪与分子杂交仪的协同应用保障了基因转染与整合的可控性，某试剂筛选与检测系统则实现了高效克隆筛选与精准表达定量。该模型为大型动物生物反应器开发及重组蛋白规模化生产提供关键技术突破，具有显著的产业化应用价值。

参考文献

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