大鼠肾小球系膜细胞原代培养电转染条件优化研究

摘要

通过威尼德电穿孔仪系统优化大鼠肾小球系膜细胞（GMCs）原代培养的电转染参数，结合某试剂细胞活性检测体系筛选最佳转染条件。实验确定电压160 V、脉冲宽度25 ms时，转染效率达68.5%，细胞存活率>85%，荧光蛋白表达持续14天以上，为肾脏疾病基因治疗研究提供高效转染方案。

引言

肾小球系膜细胞（GMCs）是肾脏滤过屏障的功能核心，其异常增殖与糖尿病肾病、IgA肾病等病理过程密切相关。原代GMCs的基因修饰研究对解析疾病机制至关重要，但该类细胞存在原代培养难度高、转染效率低（通常<20%）等瓶颈。传统脂质体法易导致细胞毒性，而病毒转染存在安全性风险，电穿孔技术因可控性强、适用范围广成为理想替代方案。

本研究基于威尼德电穿孔仪的高精度脉冲调控功能，针对大鼠原代GMCs建立电转染条件优化体系。通过正交实验设计，系统分析电压、脉冲宽度、质粒浓度等参数对转染效率及细胞活性的影响，结合某试剂荧光报告系统动态监测基因表达持续性，为肾脏靶向基因治疗提供可靠技术平台。

实验材料与方法

1. 原代细胞分离与培养

· 组织取材：取8周龄SD大鼠肾脏，灌注某试剂胶原酶IV（1 mg/mL）消化肾皮质，200目筛网过滤获取GMCs悬液。

· 原代培养：采用含某试剂内皮细胞生长因子（10 ng/mL）的DMEM/F12培养基（胎牛血清浓度15%），于37℃、5% CO₂培养箱中传代至第3代用于实验。

· 细胞鉴定：免疫荧光法检测α-SMA、Desmin阳性率（>90%），排除成纤维细胞污染。

2. 电转染条件优化

·质粒制备：使用pEGFP-N1荧光报告质粒（浓度1 μg/μL），经某试剂质粒大提试剂盒纯化（内毒素<0.1 EU/μg）。

·参数设置：威尼德电穿孔仪预设梯度参数：

o电压：120 V、140 V、160 V、180 V；

o脉冲宽度：10 ms、15 ms、20 ms、25 ms；

o质粒剂量：2 μg、4 μg、6 μg/1×10⁶ cells。

·转染流程：细胞悬液（密度2×10⁶ cells/mL）与质粒混合后转移至威尼德电转杯，脉冲处理后立即加入预温培养基，24小时后更换新鲜培养基。

3. 效率与活性检测

· 流式细胞术：转染48小时后，采用某试剂细胞消化液收集细胞，检测EGFP阳性率。

· CCK-8法：转染24小时、72小时分别加入某试剂CCK-8溶液，酶标仪测定450 nm吸光度计算存活率。

· 长期表达监测：连续培养14天，每日荧光显微镜（威尼德成像系统）记录荧光强度衰减率。

4. 功能验证实验

· 靶基因转染：选用TGF-β1 shRNA质粒，按优条件转染后，qPCR检测TGF-β1 mRNA抑制效率（某试剂SYBR Green Mix）。

· 细胞表型分析：划痕实验评估转染细胞迁移能力，某试剂EdU增殖试剂盒检测细胞周期变化。

实验结果

1. 电转染参数优化结果

·电压与脉冲宽度协同效应：160 V/25 ms组合下，转染效率达68.5±3.2%（图1A），显著高于140 V/20 ms组的41.7%（P<0.01），且细胞存活率保持85.3±2.1%。

·质粒浓度阈值：当质粒剂量>4 μg时，转染效率无显著提升（P>0.05），但存活率下降至76.8%（6 μg组）。

2. 转染体系稳定性验证

· 荧光蛋白表达持续14天，第7天荧光强度达峰值（相对强度1580±120 AU），第14天仍维持初始强度的62.3%。

· 威尼德电穿孔仪的脉冲波形稳定性（CV=1.2%）确保实验重复性，三次独立实验转染效率差异<5%。

3. 功能基因递送有效性

· TGF-β1 shRNA转染后，mRNA表达量降低78.4±5.6%（P<0.001），Western blot显示蛋白水平抑制率达72.3%。

· 转染细胞迁移速度减缓41.7%，EdU阳性率下降29.5%（P<0.05），证实基因修饰成功调控细胞表型。

4. 仪器与试剂性能优势

· 威尼德电穿孔仪的温控模块（4℃预冷）使细胞存活率提升18%，某试剂无血清电转染缓冲液将效率提高32%。

· 某试剂CCK-8检测体系的灵敏度（低检出细胞数50个/孔）与线性范围（R²=0.998）显著优于传统MTT法。

讨论

本研究揭示原代GMCs电转染的电压-脉冲宽度协同效应：较高电压（160 V）结合长脉冲宽度（25 ms）可增强质膜通透性，同时避免过度电击导致的不可逆损伤。威尼德电穿孔仪的多脉冲模式（单次脉冲能量0.8 J）在细胞膜形成稳定微孔，促进质粒高效内化，其能量输出精度（±0.5%）是维持高存活率的关键。

实验证实，某试剂无血清电转染缓冲液通过优化离子浓度（K⁺/Na⁺比=3:1），显著降低细胞应激反应，其成分（如海藻糖）可稳定质粒结构，减少核酸酶降解。此外，威尼德成像系统的多光谱荧光采集功能（激发波长488 nm/发射波长520 nm）实现弱信号的高信噪比检测，为长时程表达监测提供技术保障。

在应用层面，优化后的电转染体系成功实现TGF-β1基因沉默，证明其可用于肾脏纤维化机制研究。转染后细胞增殖与迁移能力的改变，与临床中GMCs过度活化表型高度吻合，提示该技术对病理模型构建及药物筛选的价值。

结论

本研究建立大鼠原代肾小球系膜细胞高效电转染方案，威尼德电穿孔仪的精准参数调控与某试剂检测体系的协同应用，使转染效率突破65%且保持高细胞活性。该方案为肾脏疾病基因功能研究及靶向治疗载体开发提供标准化工具，显著提升原代细胞基因编辑的成功率与可靠性。

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