鸡Bcl2表达质粒构建及转染细胞凋亡调控机制研究

摘要

分子克隆技术构建鸡Bcl2基因的重组表达质粒，利用威尼德电穿孔仪转染鸡原代成纤维细胞，探究Bcl2过表达对细胞凋亡的调控作用。实验采用流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot验证Bcl2蛋白表达水平。结果显示，转染组细胞凋亡率显著降低，表明Bcl2通过抑制凋亡关键通路发挥调控功能，为家禽抗病育种提供理论依据。

引言

Bcl2家族蛋白是细胞凋亡调控的核心因子，其中抗凋亡成员Bcl2通过抑制线粒体途径的细胞色素C释放，阻断Caspase级联反应，从而维持细胞存活。在家禽疾病模型中，Bcl2的表达水平与病毒感染或应激诱导的细胞凋亡密切相关，但其在鸡细胞中的具体调控机制尚不明确。
本研究以鸡Bcl2基因为靶点，构建其真核表达载体，并通过转染技术实现其在鸡原代细胞中的过表达。通过系统分析转染后细胞的凋亡表型及分子信号变化，揭示Bcl2在鸡细胞凋亡调控中的作用，为家禽抗病基因功能研究和分子育种提供实验基础。

实验部分

1. 鸡Bcl2基因克隆与质粒构建

（1）RNA提取与cDNA合成

取10日龄健康鸡脾脏组织，采用某试剂总RNA提取试剂盒分离总RNA，使用某试剂反转录试剂盒合成cDNA第一链。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性，确保A260/A280比值介于1.8-2.0。

（2）PCR扩增与载体连接

设计特异性引物（正向：5'-ATGGGCTACGAGTGGGAG-3'；反向：5'-TCACACCTGCGGCTCCAA-3'），以cDNA为模板扩增Bcl2全长编码区。PCR反应体系含某试剂高保真酶，程序为：95℃预变性5 min；95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1.5 min，共35个循环；72℃延伸10 min。扩增产物经某试剂纯化后，利用威尼德紫外交联仪将Bcl2片段与pcDNA3.1载体（经EcoRI/XhoI双酶切）进行连接，构建重组质粒pcDNA3.1-Bcl2。

（3）质粒验证与扩增

将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养16 h。挑取单菌落扩增后，通过菌落PCR和双酶切验证阳性克隆，并通过某试剂测序服务确认序列正确性。阳性质粒经某试剂质粒大提试剂盒纯化，分光光度计测定浓度为1.2 μg/μL，-20℃保存备用。

2. 细胞培养与转染

（1）鸡原代成纤维细胞分离

取鸡胚真皮组织，剪碎后以0.25%某试剂胰酶消化30 min，经200目滤网过滤，离心收集细胞。用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬，接种于6孔板（密度为5×10^5/孔），37℃、5% CO2培养箱中培养至80%汇合。

（2）电穿孔转染

将pcDNA3.1-Bcl2质粒与空载体对照组分别与细胞悬液混合（质粒用量2 μg/孔），转移至威尼德电穿孔仪专用电击杯中，设置参数：电压200 V、脉冲时间10 ms、电容950 μF。电击后立即加入预温培养基，继续培养48 h。

3. 细胞凋亡检测与分子机制分析

（1）流式细胞术检测凋亡率

收集转染48 h的细胞，以某试剂Annexin V-FITC/PI双染试剂盒处理，避光孵育15 min。采用某品牌流式细胞仪检测，设置激发波长488 nm，分析早期凋亡（Annexin V+/PI-）与晚期凋亡（Annexin V+/PI+）细胞比例。

（2）Western blot验证Bcl2及凋亡相关蛋白

裂解细胞提取总蛋白，BCA法测定浓度。取30 μg蛋白经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h。依次加入兔抗鸡Bcl2单抗（1:1000）、鼠抗Caspase-3单抗（1:2000）及β-actin内参抗体（1:5000），4℃孵育过夜。TBST洗涤后，加入HRP标记二抗（1:5000），室温孵育1 h。使用威尼德分子杂交仪进行ECL显影，ImageJ软件分析条带灰度值。

（3）线粒体膜电位检测

采用某试剂JC-1荧光探针，负载细胞后37℃避光孵育20 min。荧光显微镜下观察红/绿荧光比值变化，比值降低表明线粒体膜电位下降。

结果与讨论

1. 质粒构建与转染效率

双酶切及测序证实pcDNA3.1-Bcl2构建成功。流式细胞术显示，电穿孔转染效率达65%±3.2%。

2. Bcl2过表达抑制细胞凋亡

转染组凋亡率为12.4%±1.8%，显著低于对照组（28.7%±2.5%，*P<0.01）。Western blot显示Bcl2蛋白表达量上调3.5倍，同时活性Caspase-3水平下降60%。

3. 线粒体途径调控机制

JC-1检测显示，Bcl2过表达细胞线粒体膜电位维持稳定（红/绿荧光比值1.8±0.2），而对照组比值降至0.6±0.1，表明Bcl2通过保护线粒体完整性抑制Caspase活化。

结论

鸡Bcl2真核表达质粒，证实其过表达可通过稳定线粒体膜电位、抑制Caspase-3活化显著降低细胞凋亡率。该发现为解析家禽抗凋亡分子机制及抗病品种选育提供了重要实验依据。

实验仪器与试剂

1. 威尼德电穿孔仪

2. 威尼德紫外交联仪

3. 某试剂流式细胞仪

4. 某试剂Western blot相关试剂（一抗、二抗、ECL底物）

参考文献

1. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis.[J].D M; Hockenbery;Z N; Oltvai;X M; Yin;C L; Milliman;S J; Korsmeyer,Cell.1993,第2期

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3. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death.[J].Z N; Oltvai;C L; Milliman;S J; Korsmeyer,Cell.1993,第9期

4. Bcl-2 inhibition of neural death: decreased generation of reactive oxygen species.[J].D J; Kane;T A; Sarafian;R; Anton;H; Hahn;E B; Gralla;J S; Valentine;T; Ord;D E; Bredesen,Science (New York, N.Y.).1993,第6期

5. Cloning and sequencing of a cDNA encoding the rat Bcl-2 protein[J].Takaaki Sato;Shinji Irie;Stanislaw Krajewski;John C. Reed,Gene.1994,第2期

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