丙型肝炎病毒非结构蛋白4B转染细胞差异表达基因筛选研究

摘要

探究丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4B（NS4B）对宿主细胞基因表达的影响。通过构建NS4B真核表达载体，利用威尼德电穿孔仪转染Huh-7细胞，结合转录组测序技术筛选差异表达基因（DEGs）。结果显示，NS4B显著调控细胞凋亡、免疫应答及脂代谢相关通路。实验揭示了NS4B在HCV致病机制中的潜在作用，为抗病毒靶点开发提供了理论依据。

引言

丙型肝炎病毒（HCV）感染是全球慢性肝病的主要病因之一，可导致肝硬化及肝癌。其非结构蛋白NS4B作为病毒复制复合体的核心组分，参与内质网膜结构的重塑，但NS4B对宿主细胞基因表达的调控机制尚不明确。已有研究表明，NS4B可能通过干扰宿主信号通路促进病毒持续感染，但其具体靶基因及功能网络仍待解析。本研究通过转染NS4B至肝源性细胞系，结合高通量测序技术系统筛选差异表达基因，旨在阐明NS4B的宿主互作机制，为HCV治疗策略提供新方向。

实验部分

1. 实验材料与仪器

细胞与载体：人肝癌细胞系Huh-7（某试剂培养），pcDNA3.1-NS4B真核表达载体（某试剂合成）。

主要仪器：威尼德电穿孔仪（转染效率优化至75%）、威尼德紫外交联仪（核酸固定）、威尼德分子杂交仪（Southern blot验证）。

2. 实验方法

（1）NS4B表达载体构建与验证

通过PCR扩增HCV NS4B编码序列（基因型1b），克隆至pcDNA3.1载体。利用威尼德原位杂交仪进行限制性酶切及连接反应，产物经测序确认无误后，使用某试剂纯化质粒。

（2）细胞转染与分组

将Huh-7细胞分为实验组（转染pcDNA3.1-NS4B）和对照组（空载体）。采用威尼德电穿孔仪（参数：电压120 V，脉冲时长20 ms）进行转染，转染后48小时收集细胞。

（3）RNA提取与转录组测序

使用某试剂提取总RNA，Agilent 2100生物分析仪检测RNA完整性（RIN≥8.0）。建库后于Illumina NovaSeq平台进行双端测序（读长150 bp），数据经质控后比对至人类参考基因组（GRCh38）。

（4）差异表达基因筛选与分析

通过DESeq2软件（|log2FC|>1，p<0.05）筛选DEGs，利用DAVID数据库进行GO功能注释及KEGG通路富集分析。关键基因通过qRT-PCR验证（某试剂SYBR Green Mix）。

（5）蛋白质互作网络构建

基于STRING数据库构建DEGs编码蛋白的互作网络，Cytoscape软件可视化并筛选核心节点基因。

结果

1. NS4B转染效率与细胞表型

威尼德电穿孔仪转染后，Western blot证实NS4B在Huh-7细胞中高效表达。与对照组相比，实验组细胞增殖速率下降20%（p<0.01），凋亡率增加35%。

2. 差异表达基因筛选

转录组分析共鉴定到682个DEGs，其中上调基因412个（如CASP3、STAT1），下调基因270个（如PPARG、FASN）。

3. 功能富集与通路分析

GO分析表明，DEGs主要参与“凋亡信号调控"（p=3.2×10^-5）和“先天免疫应答"（p=1.8×10^-4）。KEGG通路中，“丙型肝炎感染通路"（p=0.002）和“PPAR信号通路"（p=0.005）显著富集。

4. 核心基因验证

qRT-PCR证实CASP3、STAT1表达上调2.5倍（p<0.001），PPARG下调1.8倍（p<0.01），与测序结果一致。

讨论

NS4B通过调控宿主基因表达介导HCV致病性已被多项研究推测，但本研究系统揭示其靶向脂代谢与免疫相关通路的分子机制。CASP3与STAT1的上调提示NS4B可能通过激活凋亡及干扰素信号促进肝细胞损伤，而PPARG的下调或导致脂代谢紊乱，与HCV感染后脂肪变性表型吻合。此外，蛋白质互作网络中的核心基因（如JUN、MAPK1）为后续功能研究提供了重点方向。

结论

本研究证实HCV NS4B通过调控宿主细胞凋亡、免疫及脂代谢相关基因表达，参与病毒致病过程。筛选的核心基因及通路为开发靶向NS4B的抗病毒策略提供了重要依据。后续研究将聚焦于NS4B与宿主因子的直接互作机制。

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