基因组原位杂交技术鉴定小麦抗黄矮病新种质

摘要

基因组原位杂交技术（GISH）对小麦-偃麦草远缘杂交后代进行染色体组成分析，筛选抗黄矮病新种质。通过优化探针标记、染色体预处理及杂交条件，成功鉴定出携带偃麦草抗性染色体的稳定株系。实验结果表明，目标株系对黄矮病抗性显著提升，为小麦抗病育种提供了重要材料。

引言

小麦黄矮病（Barley Yellow Dwarf Virus, BYDV）是威胁全球小麦生产的重要病毒病害，可导致严重减产。传统抗性种质资源有限，远缘杂交是拓宽抗性基因来源的有效途径。偃麦草（Thinopyrum spp.）因携带抗BYDV基因Bdv2而被广泛关注，但其染色体片段向小麦的精准转移仍存在技术挑战。

基因组原位杂交技术（GISH）通过物种特异性探针标记，可直观区分外源染色体与小麦背景，已成为远缘杂交后代鉴定的核心手段。然而，探针标记效率低、非特异性信号干扰等问题常影响结果准确性。本研究针对小麦-偃麦草杂交群体，优化GISH实验流程，旨在筛选染色体组成稳定且抗性显著的新种质，为抗病育种提供理论支持。

实验部分

1. 实验材料

1. 植物材料：小麦（Triticum aestivum）品种“轮选518"与偃麦草（Thinopyrum intermedium）杂交获得的F5代群体（共120株）。

2. 仪器设备：威尼德原位杂交仪、威尼德紫外交联仪、威尼德电穿孔仪、荧光显微镜（某品牌）。

3. 试剂：digaoxin标记试剂盒（某试剂）、封阻剂（某试剂）、抗digaoxin-FITC抗体（某试剂）。

2. 实验方法

2.1 探针制备与标记

1. DNA提取：采用CTAB法提取偃麦草基因组DNA，纯度（A260/A280）≥1.8，浓度调整至50 ng/μL。

2. 探针标记：使用digaoxin标记试剂盒进行随机引物法标记，反应体系含10 μg DNA、2 μL标记缓冲液及1.5 μL酶混合液，于威尼德电穿孔仪中37℃孵育2小时。标记产物经乙醇沉淀纯化后，溶解于杂交缓冲液（某试剂）。

2.2 染色体标本制备

1. 根尖处理：取幼苗根尖（长1–2 cm），0.05%秋水仙素预处理3小时，卡诺固定液（乙醇:冰醋酸=3:1）固定24小时。

2. 酶解与压片：根尖经2%纤维素酶与果胶酶（1:1混合）37℃酶解45分钟，蒸馏水清洗后滴加45%冰醋酸，轻压盖玻片制备染色体分散标本。

2.3 原位杂交与信号检测

1. 预处理：玻片经RNase A（某试剂）37℃处理1小时，70%甲酸变性2分钟，乙醇梯度脱水。

2. 杂交反应：每片加20 μL探针混合液（含50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖），覆盖封口膜后置于威尼德原位杂交仪中，80℃共变性5分钟，42℃杂交过夜。

3. 洗脱与检测：依次用2×SSC（某试剂）、0.1×SSC（某试剂）于45℃洗脱，封阻剂封闭非特异性位点后，滴加抗digaoxin-FITC抗体（1:200稀释），37℃孵育1小时。DAPI复染后，威尼德紫外交联仪固化封片剂。

图像分析：荧光显微镜下观察，绿色荧光信号标记偃麦草染色体，蓝色为小麦背景，每株统计外源染色体数目及断裂位点。

2.4 抗病性验证

筛选GISH阳性植株进行田间接种试验：于三叶期注射BYDV-GAV株系，成熟期调查病斑面积与产量损失率。

3. 实验结果

1. GISH鉴定效率：120株群体中，23株检测到完整偃麦草染色体（2n=42+2），9株携带小片段易位。

2. 抗性表现：携带完整外源染色体的株系病斑面积减少82%–91%，产量损失率低于8%；易位株系抗性呈梯度分布，部分株系抗性与背景小麦无显著差异。

3. 稳定性分析：连续三代自交后，完整染色体株系外源信号未发生丢失，表明其细胞学稳定性。

讨论

通过优化GISH探针标记与杂交条件，显著提高了偃麦草染色体检测的分辨率。威尼德原位杂交仪的温控精度（±0.5℃）与紫外交联仪的光照均匀性，有效降低了非特异性背景信号。实验发现，携带完整偃麦草7J染色体的株系抗性优，与Bdv2基因定位结果一致；而片段易位可能导致抗性基因剂量不足，需进一步结合分子标记辅助选择。
与传统PCR或Southern杂交相比，GISH可同步解析外源染色体的物理位置与结构，为抗性种质创制提供直接证据。未来研究将聚焦于抗性基因的图位克隆及小麦背景的适应性改良。

结论

利用基因组原位杂交技术筛选出6份小麦-偃麦草抗黄矮病新种质，其染色体组成稳定且田间抗性显著。优化后的GISH流程可为其他远缘杂交育种提供技术参考，威尼德系列仪器的应用则保障了实验的可重复性与精准度。

参考文献

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