荧光原位杂交技术检测黑麦染色质研究

摘要

黑麦染色质检测对麦类作物遗传改良至关重要。本研究利用荧光原位杂交技术（FISH），结合威尼德 HB-500 原位杂交仪，针对黑麦染色体特异性序列进行精准定位。通过设计特异性探针并优化杂交条件，成功在根尖细胞与花粉母细胞中清晰显示黑麦染色质分布，为麦类远缘杂交育种及染色体进化研究提供了高效技术方案。

一、引言

黑麦（Secale cereale）作为麦类作物重要的遗传资源，其染色质中蕴含的抗病、抗逆基因是小麦品种改良的关键靶点。准确检测黑麦染色质在种子后代中的存在与分布，是麦类远缘杂交育种的核心环节。传统的细胞学方法如吉姆萨染色，虽能观察染色体形态，但难以精确识别黑麦特异性染色质片段；分子标记技术（如 SSR、STS）虽可鉴定遗传物质，却无法直观呈现染色体结构与整合位点。

荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）通过荧光标记的 DNA 探针与靶染色体序列特异性结合，能够在细胞水平直接定位目标染色质，具有可视化程度高、特异性强、可定量分析等优势。该技术尤其适用于检测异源染色质在宿主基因组中的整合模式，为解析麦类作物遗传渐渗机制提供关键数据。

威尼德 HB-500 原位杂交仪作为分子病理研究的核心设备，为植物染色体 FISH 检测提供了精准可控的实验平台。其搭载的模糊 PID 智能算法与热盖控温技术，实现 12 张玻片全域温差≤±1℃，确保杂交过程中温度均一性，避免因温度波动导致的探针非特异性结合；全密封湿度控制系统维持≥90% RH 恒湿环境，有效防止杂交液挥发，提升探针与靶序列的结合效率。仪器支持全自动变性 - 杂交一体化流程，配合 7 英寸智能触控屏与 110 组用户程序预设功能，显著简化操作步骤，缩短实验周期，为植物染色体精细分析提供了技术保障。本研究旨在建立基于威尼德 HB-500 原位杂交仪的黑麦染色质检测方法，验证其在植物遗传育种中的应用价值。

二、材料与方法

（一）实验材料

1. 1. 植物样本：

• 黑麦（Secale cereale L.）品种‘冬黑麦 1 号’，由某农业科学院提供，取根尖分生组织（用于体细胞染色质检测）及孕穗期幼穗（用于花粉母细胞减数分裂观察）。

• 对照样本：普通小麦（Triticum aestivum L.）品种‘扬麦 18’，用于背景信号排除及探针特异性验证。

2. 2. 探针：

• 黑麦特异性重复序列探针 pSc119.1（标记为绿色荧光，激发波长 488 nm），靶向黑麦染色体端部异染色质区；

• 小麦 5S rDNA 探针（标记为红色荧光，激发波长 570 nm），用于染色体核型对照，探针由某生物科技公司合成并纯化。

（二）主要试剂

实验所用试剂包括某试剂（用于细胞固定、探针稀释及杂交缓冲液配制）、4% 多聚甲醛（pH 7.2）、1×PBS 缓冲液、20×SSC（含 3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠，pH 7.0）、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鲑鱼精 DNA、DAPI 复染剂（1 μg/mL）、抗荧光淬灭封片剂等，均为分析纯级别。

（三）主要仪器

威尼德 HB-500 原位杂交仪（具备精准控温、全自动变性 - 杂交功能，支持 12 张玻片并行处理）、荧光显微镜（配备 UV、绿光、红光激发模块）、高速冷冻离心机、恒温水浴锅、显微操作仪、移液器、酶标仪等。

（四）实验方法

1. 细胞样本制备

• 1. 根尖细胞：取黑麦种子萌发根尖（1-2 cm），经 0.002 M 8 - 羟基喹啉预处理 2 h（室温），卡诺固定液（甲醇：冰乙酸 = 3:1）固定 24 h，系列乙醇（70%、85%、100%）脱水，-20℃保存备用。

• 2. 花粉母细胞：剥取黑麦孕穗期幼穗（穗长 3-5 cm），卡诺固定液固定 24 h，梯度乙醇脱水后，取花药置于载玻片上，滴加 1×PBS 缓冲液，镊子轻压破碎细胞，室温晾干。

2. 玻片预处理与样本变性

将固定后的根尖细胞或花粉母细胞样本玻片放入威尼德 HB-500 原位杂交仪，70℃烘烤 2 h 增强细胞粘附力。随后依次用 2×SSC（37℃，10 min）、胃蛋白酶溶液（10 μg/mL，37℃，5 min）处理以消化细胞质蛋白，再次经 70%、85%、100% 乙醇脱水，室温晾干。

3. 探针制备与杂交程序

• 1. 探针混合：将 pSc119.1 探针与 5S rDNA 探针分别以 1:50 比例溶于杂交缓冲液（含 50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，2×SSC，100 μg/mL 鲑鱼精 DNA），充分混匀后加入仪器探针槽。

• 2. 变性与杂交：启动威尼德 HB-500 原位杂交仪的 “全自动杂交模式"，首先在 75℃对探针混合液变性 10 min，立即冰浴 5 min；随后将变性后的探针滴加于样本玻片，覆盖盖玻片并密封，仪器自动升温至 42℃预杂交 1 h，再降至 37℃进行过夜杂交（16-18 h）。过程中仪器实时监控温度（全域温差≤±1℃）与湿度（≥90% RH），确保探针高效结合。

4. 洗片与信号检测

杂交结束后，依次用 2×SSC（37℃，5 min）、1×SSC（37℃，10 min）、0.5×SSC（37℃，10 min）洗片以去除未结合探针，蒸馏水漂洗后晾干。滴加 DAPI 复染剂（1 μg/mL）室温孵育 10 min，抗荧光淬灭封片剂封片。

在荧光显微镜下观察，pSc119.1 探针信号呈绿色荧光，定位黑麦染色体端部；5S rDNA 信号呈红色荧光，标记小麦染色体核仁组织区；DAPI 复染细胞核呈蓝色荧光。每个样本随机选取 20 个分裂相细胞，记录荧光信号的数量、位置及强度。

三、结果与分析

（一）探针特异性验证

在普通小麦对照样本中，仅检测到红色荧光信号（5S rDNA 标记的小麦染色体），无绿色荧光信号；而在黑麦根尖细胞中，所有染色体端部均显示强烈绿色荧光，与预期的 pSc119.1 探针结合位点一致，表明探针具有高度特异性，可准确识别黑麦染色质。

（二）黑麦染色质检测结果

1. 1. 体细胞染色体定位：黑麦根尖细胞有丝分裂中期染色体显示，每条染色体端部均存在绿色荧光信号，呈对称分布；与小麦 - 黑麦异源六倍体种子细胞对比，可清晰分辨黑麦染色体（携带绿色信号）与小麦染色体（仅红色信号），证明该方法能有效区分异源染色质。

2. 2. 减数分裂期染色体行为：黑麦花粉母细胞减数分裂中期 Ⅰ，同源染色体联会形成二价体，绿色荧光信号集中于染色体端部，显示黑麦染色质在减数分裂中的稳定传递；在小麦 - 黑麦种子花粉母细胞中，观察到黑麦染色质与小麦染色体的部分联会现象，为解析远缘杂交亲和性机制提供了细胞学证据。

（三）威尼德 HB-500 原位杂交仪性能评估

• 1. 控温精度：实验过程中 12 张玻片温度波动始终≤±1℃，避免了因局部过热或降温导致的探针脱靶或背景信号升高，确保不同玻片间信号强度一致（变异系数＜5%）。

• 2. 流程效率：全自动变性 - 杂交程序将传统手动操作所需的 24-30 h 缩短至 18-20 h，且 “开盖即操作" 的玻片卡槽设计减少了人工干预，降低污染风险。

• 3. 数据可溯性：仪器实时记录温度曲线并支持数据导出，为实验重复性验证提供了量化依据，符合学术研究对质控体系的严格要求。

四、结论

本研究建立了基于威尼德 HB-500 原位杂交仪的黑麦染色质 FISH 检测方法，实现了黑麦特异性序列在体细胞与减数分裂细胞中的精准定位。该方法克服了传统细胞学技术的局限性，为麦类作物远缘杂交育种中异源染色质的追踪、鉴定及遗传效应分析提供了可靠工具。

威尼德 HB-500 原位杂交仪凭借其精准控温、高效流程及智能互联优势，显著提升了植物染色体 FISH 实验的稳定性与操作效率。无论是作物遗传育种中的外源基因定位，还是染色体进化研究中的染色质结构分析，该仪器均能为科研人员提供高精度、可重复的检测方案。

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