猪圆环病毒 2 型原位杂交检测技术的构建及应用

摘要

猪圆环病毒 2 型（PCV2）是危害养猪业的重要病原，精准检测其在组织中的分布是疫病防控关键。本研究基于威尼德 HB-500 原位杂交仪，构建 PCV2 特异性荧光原位杂交（FISH）检测技术。通过设计靶向 ORF2 基因探针并优化杂交条件，实现 PCV2 在猪肾细胞及组织样本中的单细胞水平定位，为 PCV2 致病机制研究与临床快速诊断提供高效技术平台。

一、引言

猪圆环病毒 2 型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）等疾病的主要病原体，严重威胁全球养猪业健康发展。该病毒具有感染隐蔽性强、免疫逃逸能力突出等特点，传统检测方法如 PCR 虽能定量病毒核酸，但无法直观呈现病毒在组织细胞中的时空分布；免疫组化技术依赖抗体特异性，易受交叉反应干扰，且难以实现单细胞层面的精准定位。

荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）通过荧光标记的 DNA 探针与靶病毒核酸序列特异性结合，可在组织切片或细胞样本中直接观察病毒分布，兼具高特异性与可视化优势。该技术不仅能准确识别 PCV2 感染的靶细胞类型，还可分析病毒在宿主组织中的定植模式，为解析 PCV2 致病机制、评估疫苗免疫效果提供关键细胞学证据。

威尼德 HB-500 原位杂交仪作为分子病理检测的核心设备，为 PCV2 的 FISH 检测提供了精准可控的实验平台。其搭载的模糊 PID 智能算法与热盖控温技术，实现 12 张玻片全域温差≤±1℃，确保杂交过程中温度均一性，避免因温度波动导致的探针非特异性结合；全密封湿度控制系统维持≥90% RH 恒湿环境，有效防止杂交液挥发，显著提升探针与病毒核酸的结合效率。仪器支持全自动变性 - 杂交一体化流程，配合 7 英寸智能触控屏与 110 组用户程序预设功能，可大幅简化操作步骤、缩短实验周期，为 PCV2 的高通量检测与大规模流行病学调查提供技术保障。本研究旨在建立基于威尼德 HB-500 原位杂交仪的 PCV2 原位杂交检测方法，验证其在兽医病理学与临床诊断中的应用价值。

二、材料与方法

（一）实验材料

1. 1. 生物样本：

• 病毒株：PCV2 分离株（基因型为 PCV2d），由某兽医研究所提供，接种于 PK-15 猪肾细胞进行增殖培养，收集感染 72 h 的细胞样本（用于细胞水平检测）。

• 组织样本：人工感染 PCV2 的 SPF 仔猪肾脏、淋巴结组织（经病理切片验证为典型 PCV2 感染病变），以及健康仔猪对应组织作为阴性对照，样本经 4% 多聚甲醛固定、石蜡包埋备用。

2. 2. 探针设计与制备：

• 靶序列选择 PCV2 基因组中高度保守的 ORF2 基因区域（核苷酸位置 500-700 bp），设计特异性 DNA 探针（长度 50 bp），5' 端标记 FITC 荧光素（绿色荧光，激发波长 488 nm），由某生物科技公司合成并纯化。

• 内参探针：猪 β-actin 基因探针（标记为 Cy3 荧光素，红色荧光，激发波长 570 nm），用于细胞定位与背景信号校准。

（二）主要试剂

实验所用试剂包括某试剂（用于细胞固定、探针稀释及杂交缓冲液配制）、4% 多聚甲醛（pH 7.2）、1×PBS 缓冲液、20×SSC（含 3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠，pH 7.0）、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鲑鱼精 DNA、DAPI 复染剂（1 μg/mL）、抗荧光淬灭封片剂等，均为分析纯级别。

（三）主要仪器

威尼德 HB-500 原位杂交仪（具备精准控温、全自动变性 - 杂交功能，支持 12 张玻片并行处理）、荧光显微镜（配备 UV、绿光、红光激发模块）、石蜡切片机、恒温振荡水浴锅、高速冷冻离心机、显微操作仪、移液器等。

（四）实验方法

1. 样本预处理

• 1. 细胞样本制备：收集 PCV2 感染的 PK-15 细胞，用 4% 多聚甲醛固定 30 min，1×PBS 洗涤 3 次，制备细胞爬片；健康 PK-15 细胞作为阴性对照。

• 2. 组织样本处理：石蜡包埋组织块切成 5 μm 薄片，依次经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，置于 1×PBS 中待用；组织切片经胃蛋白酶溶液（10 μg/mL，37℃，10 min）消化以增强探针通透性，再次用梯度乙醇脱水，室温晾干。

• 
  

2. 玻片预处理与变性

将细胞爬片或组织切片玻片放入威尼德 HB-500 原位杂交仪，70℃烘烤 2 h 增强样本粘附力。随后进行预处理：2×SSC（37℃，15 min）洗涤去除杂质，蛋白酶 K 溶液（20 μg/mL，37℃，8 min）消化蛋白质，经 70%、85%、100% 乙醇梯度脱水后晾干。

3. 探针混合与杂交程序

• 1. 杂交缓冲液配制：将 PCV2 ORF2 探针与 β-actin 探针分别以 1:100 比例溶于杂交缓冲液（含 50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，2×SSC，100 μg/mL 鲑鱼精 DNA），充分混匀后加入仪器探针槽。

• 2. 全自动变性 - 杂交流程：启动威尼德 HB-500 原位杂交仪的 "病毒检测专用程序"，首先对探针混合液在 95℃变性 10 min，立即冰浴 5 min；将变性探针均匀滴加于样本玻片，覆盖盖玻片并密封。仪器自动升温至 42℃预杂交 1 h，随后降至 37℃进行过夜杂交（16-18 h）。过程中仪器实时监控温度（全域温差≤±1℃）与湿度（≥90% RH），确保探针与病毒核酸高效结合。

4. 洗片与信号检测

杂交结束后，依次用 2×SSC（37℃，5 min×2 次）、1×SSC（37℃，10 min）、0.5×SSC（37℃，10 min）洗片以去除未结合探针，蒸馏水漂洗后晾干。滴加 DAPI 复染剂室温孵育 10 min，抗荧光淬灭封片剂封片。

在荧光显微镜下观察，PCV2 ORF2 探针信号呈绿色荧光，β-actin 探针信号呈红色荧光（标记宿主细胞骨架），DAPI 复染细胞核呈蓝色荧光。每个样本随机选取 50 个视野，统计荧光信号的细胞定位、强度及感染细胞比例。

三、结果与分析

（一）探针特异性验证

在健康 PK-15 细胞与健康仔猪组织切片中，仅检测到红色荧光信号（β-actin 标记的宿主细胞），无绿色荧光信号；而在 PCV2 感染的 PK-15 细胞中，细胞质内可见明显绿色荧光颗粒，呈散在或聚集分布；感染仔猪肾脏肾小管上皮细胞、淋巴结巨噬细胞的细胞质及细胞核周边均观察到强绿色荧光信号，与 PCV2 在宿主细胞中的复制位点一致。结果表明，ORF2 探针能特异性识别 PCV2 核酸，无交叉反应。

（二）PCV2 检测灵敏度与定位分析

1. 1. 细胞水平检测：在感染复数（MOI）为 0.1 的 PK-15 细胞中，可检测到单个细胞内的绿色荧光信号，灵敏度达 10³ 拷贝 / 细胞；随着感染时间延长（24-72 h），荧光信号强度逐渐增强，且在多核巨细胞中呈现区域性聚集分布，提示 PCV2 在细胞内的复制与组装具有时空特异性。

2. 2. 组织原位定位：感染仔猪肾脏组织中，PCV2 信号主要定位于肾小管上皮细胞与肾间质巨噬细胞，肾小球区域未见明显信号；淋巴结组织中，荧光信号集中于皮质区的淋巴细胞与窦组织细胞，髓质区信号较弱。该分布模式与 PCV2 所致间质性肾炎、淋巴结炎的病理损伤部位高度吻合，为解析病毒组织嗜性与致病机制提供了直观证据。

（三）威尼德 HB-500 原位杂交仪性能评估

• 1. 控温稳定性：连续 72 h 监测显示，12 张玻片温度波动均≤±1℃，不同玻片间 PCV2 信号强度变异系数＜8%，显著优于传统水浴锅杂交（变异系数＞30%），避免了因局部温度不均导致的假阴性结果。

• 2. 流程效率优化：全自动程序将传统手动操作所需的 28-32 h 缩短至 20-22 h，且 "开盖即操作" 的玻片卡槽设计减少了人工干预步骤，降低了污染风险。仪器支持多批次样本并行处理，单次可同时检测 12 份样本，大幅提升批量检测效率。

• 3. 数据可追溯性：仪器实时记录温度曲线、杂交时间等关键参数并支持 Excel 格式导出，为实验重复性验证与质量控制提供了量化依据。在 3 次独立重复实验中，相同样本的荧光信号定位与强度一致性达 95% 以上，符合国际标准对分子病理检测的可溯性要求。

四、结论

本研究成功构建了基于威尼德 HB-500 原位杂交仪的猪圆环病毒 2 型原位杂交检测技术，实现了 PCV2 在细胞与组织样本中的精准定位与可视化分析。该技术突破了传统检测方法的局限性，既能特异性识别病毒核酸，又能直观呈现病毒在宿主中的感染路径与细胞嗜性，为 PCV2 的致病机制研究、疫苗效果评价及临床病理诊断提供了高效工具。

威尼德 HB-500 原位杂交仪凭借其精准的温度控制、高效的全自动流程及智能的数据管理功能，显著提升了 PCV2 原位杂交实验的稳定性与操作效率。无论是兽医实验室的病原定位研究，还是规模化猪场的临床样本筛查，该仪器均能为科研人员与兽医工作者提供高精度、可重复的检测方案。

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参考文献

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