在常规细胞系中已经做通CRISPR实验，并不意味着换成原代细胞以后同样可以顺利复制。很多研究人员第一次进行原代细胞CRISPRCas9电转时都会发现一个明显变化：参数变得更加“敏感”了。稍微温和一些，编辑效率不够；稍微加强一点，细胞活率又快速下降。这并不罕见。相较于部分长期培养、适应性较强的细胞系，原代细胞通常对外界刺激更加敏感，可接受的电转条件窗口也可能更窄。为什么CRISPR越来越需要考虑原代细胞？随着基因功能研究、疾病模型、细胞治疗以及精准医学研究不断深入，很多项目已经...

第一次做CRISPRCas9电转时，很多实验人员最想知道的一个问题就是：“到底应该设置多少伏？”但如果真正长期做过电转实验，就会发现这个问题并没有一个适用于所有实验室的标准答案。因为CRISPRCas9电转参数并不是只由Cas9决定，而是由细胞、递送物、电转体系以及实验目标共同决定。所以，与其寻找一套网络上所谓的“标准参数”，不如建立一套可以持续复用的参数优化方法。第一步：先确定你到底在递送什么CRISPRCas9实验常见的递送形式包括Cas9质粒、Cas9mRNA以及Cas...

做CRISPR基因编辑时，最让实验人员头疼的情况之一，就是电转前细胞状态很好，电转完成几个小时后却开始大量死亡。尤其是在原代细胞、干细胞、免疫细胞等对外界刺激较敏感的样本中，这种情况更加常见。很多人因此会认为：CRISPRCas9电转是不是本身就特别伤细胞？其实，电穿孔确实会暂时改变细胞膜通透性，但细胞死亡严重并不意味着电转方法本身不可用，更常见的原因是脉冲条件、细胞状态和实验流程之间没有达到合适平衡。电转不是电压越低越安全有些实验人员发现高电压导致细胞死亡后，会直接大幅降低...

在CRISPR基因编辑实验中，很多研究人员都会遇到一个比较典型的问题：Cas9、sgRNA都准备好了，细胞状态看起来也没有明显异常，但真正完成电转之后，编辑效率却始终达不到预期。于是很多人的第一反应就是：是不是电压不够？实际上，在CRISPRCas9电转过程中，单纯提高电压并不一定能够换来更高的编辑效率。相反，如果电场强度超过细胞耐受范围，还可能出现大量细胞死亡，最终形成“导入提高了一点，但有效活细胞减少很多”的情况。CRISPRCas9电转真正要看的，是整个导入过程CRIS...

电穿孔实验看起来流程并不复杂：准备样品、加入核酸、装入电转杯、设置参数、进行脉冲。但真正开始实验之后，很多人会发现结果并没有想象中稳定。尤其刚开始接触电转技术时，如果连电转染和电转化的区别都没有弄清楚，就容易把不同实验体系的方法混在一起。下面从实际实验角度，把两者区别以及常见失败原因梳理一次。一、电转染与电转化最大的不同是什么？简单来说：电转染更多用于将外源核酸等分子导入哺乳动物细胞等真核细胞；电转化更多用于将DNA导入细菌、酵母等微生物体系。两者的共同点都是利用短时间电脉冲...

准备购买电穿孔仪时，不少客户会遇到一个看似简单的问题：“我要做的到底属于电转染，还是电转化？”如果只是看设备名称，很容易越看越乱。有的设备叫电穿孔仪，有的叫电转仪，有的强调电转染，还有的强调电转化。实际上，与其纠结设备叫什么，不如先从实验本身出发。了解电转染和电转化的区别之后，设备选择会简单很多。一、先根据实验对象进行判断如果实验对象主要包括：HEK293、CHO等常见细胞；原代细胞；干细胞；T细胞；NK细胞；PBMC；肿瘤细胞；其他哺乳动物细胞，并且实验目的是导入DNA、R...

实验室里一个非常常见的场景是：在论文或者实验方案中找到一组电穿孔参数，按照相同电压和时间操作，结果别人实验成功，自己的实验却几乎没有效果。尤其是在电转染和电转化实验中，这种情况非常普遍。问题往往不是“参数写错了”，而是忽略了电转染和电转化的区别以及实验条件之间的差异。一、文献参数为什么不能直接照搬？一套完整的电穿孔条件，远远不只是一个电压数字。它通常包括：细胞类型；细胞状态；细胞浓度；电转缓冲液；电转体积；电极间距；核酸类型；核酸浓度；电压；脉冲时间；脉冲次数；电转后的恢复条...

很多实验人员第一次接触电穿孔技术时，会认为电转染和电转化只是叫法不同。实际上，两者虽然都利用电脉冲提高细胞膜通透性，但面对的样品体系、实验目的以及参数要求都有明显区别。如果正在采购电穿孔仪，或者准备建立新的实验体系，先弄清楚电转染和电转化的区别，通常比直接找一套所谓的“标准参数”更加重要。一、为什么同样是电穿孔，参数差别却很大？原因首先来自细胞本身。哺乳动物细胞、原代细胞、免疫细胞、细菌、酵母，它们的大小、膜结构、细胞壁以及耐受能力并不一样。例如很多哺乳动物细胞体积相对较大，...